響應面優化超聲輔助提取芥藍多酚工藝研究

黃曉梅 謝丹丹 陳 昕 石麗榮 胡杰華 馮晨 曾瑞娟

摘 要：采用超聲輔助法提取芥藍多酚，并通過響應面法對提取工藝進行優化。以液料比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間4個因素進行單因素試驗，在此基礎上，以芥藍多酚提取率為響應值，應用Box-Behnken法進行四因素三水平的試驗設計和優化，得到芥藍多酚最佳的提取工藝條件為液料比38mL/g、乙醇濃度61%、超聲溫度63℃和超聲時間34min。此時芥藍多酚提取率為15.03mg/g，與該模型的預測值（15.18mg/g）相比，兩者相對誤差為0.99%，說明該回歸模型得到的提取工藝參數可靠，準確性較高，可以利用響應面法優化芥藍多酚的提取。研究結果為芥藍多酚的提取與開發提供了新的方向。

關鍵詞：芥藍;多酚;響應面;超聲輔助;優化

中圖分類號 TS255 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）23-0030-06

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Polyphenols from Chinese Kale Using Response Surface Methodology

HUANG Xiaomei et al.

（Xiamen Ocean Vocational College， Xiamen 361100， China）

Abstract： Ultrasound-assisted extraction of polyphenols from Chinese kale was used in this experiment， and the extraction process was optimized by response surface methodology. Single factor experiments were carried out with four factors： liquid-to-material ratio， ethanol concentration， ultrasonic temperature and ultrasonic time. On this basis， with the extraction rate of Chinese kale polyphenols as response value， Box-Behnken was used to design and optimize the experiment at four factors and three levels. The optimum extraction conditions of Chinese kale polyphenols were obtained as follows： 38 mL/g of liquid-solid ratio， 61% of ethanol concentration， 63℃ of ultrasonic temperature， 34 minutes of ultrasonic time. The extraction yield of Chinese kale was 15.03 mg/g， compared with the best predictive value of the model （15.18mg/g）， the relative error was 0.99%， which indicated that the extraction process parameters obtained by the regression model were reliable and accurate. Response surface methodology could be used to optimize the extraction of polyphenols in Chinese kale， which provided a theoretical basis and a new direction for the extraction and development of polyphenols in Chinese kale.

Key words： Chinese kale; Polyphenols; Response surface methodology; Ultrasonic assisted; Optimization

芥藍（Brassica alboglabra L.H. Bailey）又被稱為綠葉甘藍、蓋菜，作為甘藍的一個變種，是十字花科類的重要植物，也是我國著名的特色蔬菜之一[1-2]。芥藍甜脆味美，所含有的營養價值和藥用價值較高。芥藍中含有的營養成分種類豐富，如維生素C、纖維素、糖類、多酚等，具有消暑解熱、軟化血管、預防心臟病等多種作用[3-4]。其中多酚是存在于植物的葉片、根、皮、殼和果肉中的一種酚類化合物的復雜次級代謝產，具有很多生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抑制心血管疾病以及抗骨質疏松等，已廣泛應用于農業、醫學、食品、日化等相關領域中，發揮著至關重要的作用[5]。

本研究以芥藍為原料，采用超聲波強化輔助提取芥藍中的多酚，在單因素試驗基礎上，研究液料比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間等4個因素對芥藍多酚提取率的影響，并結合響應面法進行優化，得到了最佳的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 原料為芥藍，用蒸餾水將采購的芥藍浸泡洗凈，去除泥沙，晾干后切碎平鋪在50 ℃鼓風干燥箱中進行烘干，然后取出進行粉碎，選擇60目篩，過篩后保存備用。

1.1.2 試劑 福林酚試劑，自制;沒食子酸，分析純，天津瑞金物化學品有限公司;食用酒精（乙醇），食品醫藥級，河南浩宇食品添加劑有限公司;其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設備 BS224S電子天平;HH-2數顯恒溫水浴鍋，金壇市新航儀器廠;WKYIII-100微量移液器，上海邦西儀器科技有限公司;KQ-100TDE型高頻數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司;UV-7504（A）型紫外/可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制作 采用福林-酚法[6]，按文獻方法以沒食子酸為標準品，并在765nm波長處測定標準品的吸光度值。將不同體積的0.1mg/mL的沒食子酸標準溶液分別按0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL和0.5mL的福林-酚試劑加入10mL容量瓶中，充分混合均勻，靜置1min，再加入1.5mL 20%的碳酸鈉溶液后用蒸餾水定容至10mL，然后將容量瓶放置于75℃水浴鍋中反應10min后取出，待冷卻后測量其在765nm波長處的吸光度值。根據上述試驗數據繪制標準曲線，該標準曲線以沒食子酸濃度（mg/L）為橫坐標，以各個樣品所測量的吸光度值為縱坐標。

1.2.2 芥藍多酚的提取工藝 準確稱取1g芥藍粉末，裝進100mL的圓底燒瓶中，加入一定量的乙醇、沸石，裝上回流裝置，然后置于超聲清洗器中進行超聲回流提取，提取結束后過濾得濾液，移取1mL進行稀釋一定倍數后備用。

1.2.3 多酚含量的測定 根據福林-酚法，量取1mL經稀釋一定倍數后的提取液于10mL容量瓶中并定容，再按照標準曲線的測定方法測定提取液在765nm波長處的吸光值。根據標準曲線和測得的樣品吸光值計算出樣品中芥藍多酚的濃度，通過回歸方程計算得到芥藍多酚的提取率。其計算公式如下：

多酚提取率（mg/g）=[C×N×VM×103×100] （1）

式中：C為芥藍多酚質量濃度（mg/L）;V為提取液體積（mL）;N為稀釋倍數;M為芥藍葉質量（g）。

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 液料比 準確稱取1g芥藍葉粉末，分別加入不同體積的60%乙醇25、30、35、40和45mL，置于60℃的超聲波清洗器中浸提，浸提時間為35min。浸提結束后取出冷卻，取其上清液進行定容，考察不同液料比對芥藍多酚提取率的影響，確定最佳液料比。

1.2.4.2 乙醇濃度 準確稱取1g芥藍粉末，分別加入不同濃度的乙醇溶液35mL，其濃度分別為50%、55%、60%、65%、70%（體積分數）。然后置于60℃的超聲波清洗器中浸提，浸提時間為35min。浸提結束后取出冷卻，取其上清液進行定容，考察不同乙醇濃度對芥藍多酚提取率的影響，確定最佳乙醇濃度。

1.2.4.3 超聲溫度 準確稱取1g芥藍葉粉末，加入35mL 60%的乙醇，然后分別在不同溫度的超聲波清洗器中浸提，溫度分別為50℃、55℃、60℃、65℃、和70℃。浸提時間為35min。浸提結束后取出冷卻，取其上清液進行定容，考察不同超聲溫度對芥藍多酚提取率的影響，確定最佳超聲溫度。

1.2.4.4 超聲時間 準確稱取1g芥藍葉粉末，加入35mL 60%的乙醇，在60℃的超聲波清洗器中浸提，浸提時間分別為25、30、35、40和45min，考察不同超聲時間對芥藍多酚的提取率的影響，確定最佳超聲時間。

1.2.5 響應面優化試驗設計 選擇液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）4個因素進行單因素試驗。在此基礎上，以芥藍多酚的提取率為響應值，基于Box-Behnken的設計原理進行四因素三水平的試驗設計，并優化該試驗得到的芥藍多酚的提取工，具體因素與水平如表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對芥藍多酚提取率的影響 由圖1可知，當液料比在20～30mL/g，芥藍多酚的提取率變化較為明顯，液料比不斷增大時，提取率不斷增加，原因是液料比的增加使芥藍中的多酚和溶劑之間的濃度差不斷加大[7]，而且原料與溶劑之間的接觸面積不斷增大，因此芥藍多酚的提取率會不斷增加。當液料比為30mL/g時，原料與溶劑之間結合充分達到飽和，芥藍多酚提取率得到最大。然而當液料比過大時，過量的溶劑會導致其他物質過度溶出，與多酚競爭，導致提取率降低。因此，綜合考慮到降低能耗、成本等方面情況，較為合適的料液比選擇為30mL/g。

2.1.2 乙醇濃度對芥藍多酚提取率的影響 由圖2可知，當乙醇濃度在50%～60%，隨著其濃度的不斷增大，芥藍多酚的提取率也明顯逐漸提高。提取率在乙醇濃度為60%時取得最大值。超過60%后，芥藍多酚的提取率隨著乙醇濃度的增加而逐漸降低。這是因為當乙醇濃度過低時，提取劑中有較高比例的水，會使得糖類等水溶性物質過量溶解[8]，從而降低多酚得率。而且乙醇濃度的增大會降低了溶劑的極性，使得芥藍顆粒內多酚與蛋白質、多糖等物質間的氫鍵更容易被破壞，從而提高多酚提取率;但當乙醇濃度過高時，材料的脂溶性物質會過量溶出[9]，而且因溶劑的極性較弱，會大大增加芥藍顆粒中的醇溶性物質的競爭性溶出，阻礙多酚溶出。較為合適的乙醇濃度選擇60%。

2.1.3 超聲溫度對芥藍多酚提取率的影響 由圖3可知，當超聲溫度在50～60℃，芥藍多酚的提取率隨著超聲溫度的升高逐漸提高，超聲溫度為60℃時，多酚提取率最大。原因是超聲溫度的逐漸升高，慢慢加大了分子的平均動能，多酚的溶出與擴散加快，使芥藍多酚提取率不斷提高。而溫度過高時多酚類物質會發生氧化[10]，多酚物質結構被破壞，并且過高的溫度會導致溶劑更容易揮發，造成損失，以及芥藍中其他成分更容易過量溶出，從而使得提取率降低。較為適宜的超聲溫度選擇60℃。

2.1.4 超聲時間對芥藍多酚提取率的影響 由圖4可知，當超聲時間在20～35min，超聲時間的不斷增加，芥藍多酚的提取率也逐漸提高，芥藍多酚提取率在超聲時間為35min時達到最大值。由Fick擴散定律可知，在一定范圍內，超聲波時間越長提取率越高，多酚提取率與超聲時間成正比[11]。所以當超聲時間的不斷增加時，芥藍中的多酚會逐漸溶出，不斷提高芥藍多酚的提取率，但當超聲時間過長時，超聲波的空化作用、機械及剪切效應會使多酚發生氧化、聚合等副反應而被破壞[12]，芥藍多酚的提取率也不斷降低。較為合適的超聲時間為35min。

2.2 芥藍多酚提取的響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面設計及結果分析 在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken方法設計出四因素三水平試驗，結果如表2所示。使用Design Expert 8.05b軟件對表2的試驗數據進行響應面分析，方差結果如表3所示。

分析根據Box-Benhnken試驗設計方法所獲得的29組試驗結果，在液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）4個單因素試驗的基礎上，得到以芥藍多酚提取率（Y）為響應值的四元二次回歸模型：

Y=14.97+0.54A-0.43B+0.17C-0.087D-0.035AB+0.19AC-0.045AD+0.35BC-0.17BD-0.17CD-0.55A2-0.38B2-0.39C2-0.51D2

用方差分析上述的回歸模型，用以檢驗試驗所考察的各種因素對芥藍多酚提取率的影響，其結果見表3。然后使用F檢驗來確定響應值受回歸方程中各變量影響的顯著性。由表3可知，該回歸模型的F=10.34，P<0.0001，這說明該模型極顯著，同時該方程的相關系數R2=0.9118，說明該模型的預測值與試驗值的相關性較高，擬合度較好，該回歸模型可以用來預測與解釋超過91%的試驗值;該模型的失擬度F=4.18，P=0.0902>0.05，說明其擬合度良好，差異不顯著，具有較小的試驗誤差;變異系數（C.v.%=1.71）<5%，說明該模型具有較好重復性。根據分析F及P值可以得到本試驗所考察的芥藍多酚提取率受4個因素的影響順序分別為：液料比>超聲溫度>提取時間>乙醇濃度。其中一次項A，二次項A2、B2、C2、D2影響極顯著（P<0.01），一次項C，交互項BC，有顯著影響（P<0.05）;一次項B、D，交互項AB、AC、AD影響不顯著（P>0.05）;說明芥藍多酚的提取率受各因素的影響不是簡單的線性關系。綜合上述試驗結果分析可知，試驗所得的回歸模型的準確度和可靠性較高，可以較好地描述各因素與響應面值之間的關系，可以用來對芥藍多酚的提取率進行預測和分析。

2.2.2 響應曲面圖分析 試驗所得的響應面曲面圖和等高線圖如圖5～10所示，本試驗所考察的芥藍多酚的提取率受液料比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間等4個因素之間的兩兩交互作用的影響，能從圖中響應面曲面的坡度和等高線的疏密來反映出。結合三維響應曲面與二維等高線可分析出幾個自變量對響應值的影響情況，等高線中橢圓的離心率越大，響應面中圖形的曲線越陡，說明其交互作用影響越顯著。

從下列圖中可知響應曲面坡度最陡和等高線最密的是BC，也就是說乙醇濃度和超聲溫度的交互作用對芥藍多酚的影響最為顯著。而AC的響應曲面坡度最陡程度次之，等高線最密程度也次之，說明對芥藍多酚的影響程度次之的是液料比和超聲溫度的交互作用。同理可知，本試驗所考察的芥藍多酚提取率受到各因素之間的交互作用的影響顯著性的順序為：BC乙醇濃度和超聲溫度>AC液料比和超聲溫度>CD超聲溫度和超聲時間>BD乙醇濃度和超聲時間>AD液料比和超聲時間>AB液料比和乙醇濃度。

2.3 最佳工藝條件的確定與驗證 通過分析已建立的回歸模型，得到本試驗中芥藍多酚的最佳提取工藝如下：液料比37.94mL/g、乙醇濃度61.01%、超聲溫度62.56℃、超聲時間33.85min，在此條件下，芥藍多酚提取率的預測值為15.18mg/g。為驗證該回歸方程的準確性，對得到的最佳工藝進行檢驗，并且為了試驗便利，修正各工藝條件，選取液料比為38mL/g、乙醇濃度為61%、超聲溫度為63℃、超聲時間為34min，并按修正后條件進行3次平行試驗，測得其提取率平均值為15.03mg/g，與該模型的預測值（15.18mg/g）相比的相對誤差只有0.99%，說明該回歸模型的準確性和可信度較高，驗證了該模型的有效性。因此，可以利用響應面法優化芥藍多酚的提取，這對于芥藍多酚的提取與開發提供一定的理論依據和新的方向。

3 結論

以芥藍為原料，考察影響芥藍多酚的各工藝因素，結合響應面法優化試驗所得的芥藍多酚提取工藝，建立了超聲輔助提取芥藍多酚回歸模型：Y=14.97+0.54A-0.43B+0.17C-0.087D-0.035AB+0.19AC-0.045AD+0.35BC-0.17BD-0.17CD-0.55A2-0.38B2-0.39C2-0.51D2。該回歸模型準確性和可信度較高，通過檢驗模型的顯著性，可以得到各因素影響芥藍多酚提取率的順序如下：液料比>超聲溫度>超聲時間>乙醇濃度。

在單因素試驗的基礎上，結合響應面法優化得出超聲輔助提取芥藍多酚的最佳條件為：液料比38mL/g、乙醇濃度61%、超聲溫度63℃、超聲時間34min，在此最優工藝條件下進行平行試驗測得芥藍多酚提取率的平均值為15.03mg/g，模型的預測值（15.18mg/g），兩者相比其相對誤差為0.99%。表明該模型可以準確可靠地用于預測和分析芥藍多酚的提取，也為芥藍多酚的試驗研究和資源開發提供了參考依據。

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（責編：張宏民）