基于功能磁性材料和固相微萃取凈化富集一體化的茶飲料中三唑類農藥殘留分析

王 嬌, 齊沛沛, 虞 淼, 黃志明, 王新全*,

(1. 浙江省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所，農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，杭州310021；2. 浙江省植保檢疫與農藥管理總站，杭州 310004；3. 浙江養生堂天然藥物研究所有限公司，杭州 310024)

三唑類殺菌劑是含有1,2,4-三唑環的有機含氮雜環類化合物，具有廣譜、高效及殘效期長等特點，常用于茶葉種植過程中防治各種病害，雖然目前登記用于茶樹上的僅苯醚甲環唑一種，但實際生產中普遍存在違規使用其他三唑類殺菌劑的情況。該類農藥具有內分泌干擾作用，長期低劑量暴露帶來的健康風險不容忽視[1]。作為茶葉提取物，茶飲料同樣具有農藥殘留的風險。隨著對健康的不斷重視，茶飲料中農藥殘留檢測日益受到消費者關注[2]。因此，構建茶飲料中三唑類殺菌劑的靈敏分析技術對于開展后續的食用安全風險評估具有重要的技術支撐作用。

茶飲料中農藥殘留具有殘留量低的特點，目前主要采用固相萃取、液?液萃取[3-6]等具有較強富集能力的前處理技術，但存在操作繁瑣、有機試劑用量大、檢測成本高等不足。固相微萃取(SPME) 技術集富集和凈化于一體，具有操作簡便、無需溶劑、易與檢測儀器聯用等優點[7-11]。依據目標分析物的揮發性與極性，合理選用萃取纖維材料，可有效富集目標化合物，實現快速、高效的樣品檢測。但由于SPME方法中萃取纖維長時間與樣本作用，大量化學或物理性質相近的物質同時被富集，基質干擾不可避免，為后續分析的準確定性、定量帶來極大難度[12]，因此，凈化基質樣品是提高SPME 方法適用性和定量準確性的關鍵。

磁性材料具有超順磁性、高比表面積、懸浮穩定性、易功能化修飾、易分離目標分析物等優勢，是近年國內外研究的熱點[13-15]。磁性材料在完成樣品富集或凈化后，可以與基質溶液快速分離，是理想的快速樣品前處理材料，在分析化學領域展現出廣闊的應用前景[16-17]。針對基質特點，合理設計并有針對性的研制功能化磁性材料，使基質中的雜質結合在磁性材料表面，而目標化合物仍保留在液相體系中，并結合SPME 的高效富集特點，可實現農藥多殘留分析簡便、靈敏而準確的目標。

目前，針對茶飲料中農藥殘留檢測技術的研究主要集中在菊酯類、有機氯類和新煙堿類農藥，鮮有三唑類農藥殘留檢測技術的研究報道[18-20]；同時，SPME 富集結合磁性固相凈化協同技術的研究也未見報道。因此，本研究針對茶飲料中有機酸和茶多酚等干擾物質，選擇修飾了N-丙基乙二胺 (PSA) 的四氧化三鐵磁性材料 (Fe3O4-PSA)為凈化劑，以三唑類殺菌劑為研究對象，構建SPME 富集和功能磁性材料凈化的協同技術，以期使目標三唑類藥物在萃取纖維上的富集和有機酸等雜質的去除同時進行，有效縮短樣品前處理時間，改善復雜樣品的凈化效果，提高樣品定性、定量分析的準確性，提高農藥殘留分析檢測能力。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

19 種三唑類殺菌劑標準品 (表1) 和內標物外99.8%環氧七氯，均購于上海農藥研究所；甲醇(色譜純) 購于Merck 公司；氯化鈉、氫氧化鈉和鹽酸，購自華林化工；甲酸銨 (HPLC 級) 購于美國Tedia 公司；茶飲料為超市購置的瓶裝綠茶(糖、脂肪、蛋白質含量為0 mg/kg，茶多酚含量≥160 mg/kg) 。四氧化三鐵-N-丙基乙二胺(Fe3O4-PSA) 為自制磁珠，制備過程及表征見參考文獻[21]；數顯恒溫磁力攪拌器和SPME 手柄，購于Sigma-Aldrich 公司。Agilent 氣相色譜(6890N) -質譜聯用儀 (5975) ，購于北京安捷倫科技有限公司。SPME 萃取頭 (涂覆85 μm 聚丙烯酸酯 (PA) 的石英玻璃萃取纖維) ，購于默克Sigma生物公司；SAX 固相萃取柱，購于天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 標準溶液配制及標準曲線繪制

將19 種藥劑標準品分別溶解于丙酮中，配制成一定質量濃度 (1 000 ～ 2 000 mg/L) 的單標儲備液；分別準確移取一定量的單標儲備液于25 mL容量瓶中，混勻，丙酮定容至25 mL，配制成20 mg/L 的混合標準儲備液，于4 ℃保存，使用時根據需要稀釋成不同濃度的標準工作溶液。將20 mg/L 的混合標準儲備液用丙酮逐級稀釋至質量濃度為0.002、0.005、0.02、0.05、0.1 和0.2 mg/L的溶劑標準溶液。同時，將20 mg/L 的混合標準儲備液用茶飲料基質空白提取液逐級稀釋至質量濃度為0.002、0.005、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L的基質匹配標準溶液。以目標化合物質量濃度為橫坐標(x)，對應峰面積 (y) 為縱坐標繪制標準曲線。

1.3 檢測條件

色譜條件：Agilent HP-5MS 色譜柱 (15 m × 0.25 mm, 0.25 μm)；載氣為氦氣；柱流速為1 mL/min；柱溫箱程序升溫梯度：初始柱溫60 ℃，保留1 min，然后以30 ℃/min 的速率升溫至210 ℃，保留1 min，繼續以8 ℃/min 的速率升溫至280 ℃，保留5 min；進樣量1 μL；進樣口溫度230 ℃。

質譜條件：EI 離子源；傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度230 ℃；EI 電子能量70 eV；燈絲電流100 A；采用選擇離子監測模式測定化合物，離子信息見表1。

表1 19 種三唑類農藥的保留時間和特征離子Table 1 Retention time and characteristic ions of 19 triazole pesticides

1.4 試驗方法

1.4.1 固相微萃取處理方法 稱取0.75 g 氯化鈉于含有15 mL 茶飲品的棕色樣品瓶中，加入30 mg Fe3O4-PSA，置于數顯恒溫磁力攪拌器上，于55 ℃恒溫水浴下，用SPME 萃取頭在1 500 r/min 條件下浸入萃取40 min 后取出，置于GC-MS 進樣口解析6 min，供GC-MS 分析。

1.4.2 固相萃取處理方法 參考文獻中固相萃取(SPE) 方法進行方法[22]并加以改進，采用SAX SPE 柱對三唑類農藥進行富集：用12 mL 純水、12 mL 甲醇和12 mL 正己烷依次活化SAX 柱，保持固相萃取柱處于浸潤狀態；將15 mL 茶飲料樣品上柱富集，流速約為0.5 mL/min，待上樣完畢，用15 mL 甲醇洗脫；收集洗脫液，氮氣吹至近干，加入1 mL 甲醇溶解殘渣后過0.45 μm 濾膜，供GC-MS 分析。

1.4.3 添加回收試驗 采用茶飲料空白樣品中進行添加回收試驗，添加水平為0.002、0.01 和0.02 mg/L，每個水平重復3 次，按照優化的試驗方法，通過基質匹配標準溶液線性回歸方程計算樣品中農藥殘留濃度，進一步計算回收率及相對標準偏差 (RSD)。

2 結果與分析

2.1 SPME 條件優化

試驗檢測靈敏度與萃取條件密切相關。首先，萃取未達到平衡之前，萃取時間越長，萃取效率越高，響應值也越高；其次，萃取溫度越高，擴散系數越大，擴散速度隨之增大，但升溫同時會使待測物分配系數減小，影響SPME 萃取頭的吸附量；此外，樣品溶液中鹽的存在會增加溶液離子強度，降低待測物在溶液中的溶解度，提高分配系數，增強待測物響應值[23]；pH 值會影響待測物和雜質在溶液中的帶電性，進而影響萃取針和磁性材料的吸附量[24]。因此，本研究針對萃取時間、萃取溫度、氯化鈉用量及pH 值進行了優化。方法優化過程中各化合物的添加水平均為0.05 mg/L。

2.1.1 萃取時間優化 基于萃取溫度 (55±1) ℃、氯化鈉用量5 %、pH=7、解析時間6 min 為固定萃取條件，比較不同萃取時間 (20、30、40、50、60、80、100 min) 的萃取效果。為了更清晰地展示化合物峰面積在不同條件下的差異，采用歸一化法進行處理，以20 min 時各化合物的峰面積為1，計算其他條件下峰面積與20 min 時峰面積的比值。由圖1A 可知，在20 ～ 80 min 之間，隨著萃取時間的延長，各農藥組分的響應值均增大，當萃取時間為100 min 時，響應值下降。綜合不同萃取時間對農藥響應值的影響程度，并且考慮過長的萃取時間不利于試驗進度，最終選擇40 min 作為最佳萃取時間。

2.1.2 萃取溫度的優化 基于萃取時間40 min、氯化鈉用量5 %、pH=7、解析時間6 min 為固定萃取條件，比較不同萃取溫度 (25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃) 的萃取效果 (圖1B，以25 ℃時的響應值為1，對其他條件下的響應值進行歸一化處理) 。結果發現，隨著溫度的升高，各農藥組分的響應值均增大，但65 ℃時對各農藥響應值的影響程度差異較大，如三唑酮、多效唑、環唑醇、乙環唑的歸一化響應值大于9，而氟硅唑、糠菌唑、種菌唑和聯苯三唑醇的歸一化響應值小于3，響應變化較大，說明此8 種農藥對65 ℃溫度敏感程度相差較大；此外，65 ℃條件下各化合物峰面積的相對標準偏差 (n=3) 明顯高于其他條件 (歸一化數據處理后未體現在圖中) ，其中多效唑等11 種農藥的RSDs 大于20%，因此最終選擇 (55±1) ℃為最佳萃取溫度。

2.1.3 氯化鈉用量的優化 基于萃取時間40 min、萃取溫度 (55±1) ℃、pH=7、解析時間6 min 為固定萃取條件，比較了不同氯化鈉用量 (0、5%、10%、15%、20%) 的萃取效果 (圖2A，以0 時的響應為1，對其他條件的響應值做歸一化處理) 。結果發現，隨著氯化鈉用量的增加，部分農藥的響應值越來越大；但也有一部分農藥當氯化鈉用量自5%升為10%時，響應值不升反降；并且當氯化鈉用量超過10%時，對不同農藥響應值的影響程度差異懸殊。這可能是由于氯化鈉影響了各農藥在水相和有機相間的分配系數所致。因此，最終選擇氯化鈉用量為5%。

2.1.4 pH 值的優化 基于萃取時間40 min、萃取溫度 (55±1) ℃、氯化鈉用量 5%、解析時間6 min 為固定萃取條件，比較了不同pH 值 (pH=5、6、7、8，以1 mol/L 的NaOH 或HCl 調節) 的萃取效果，結果如圖2B所示 (以pH=5 時的響應值為1，對其他條件響應值做歸一化處理) 。從中可看出：pH 值對農藥響應值的影響不大，由于pH=7 時多種農藥達到要求響應值，且考慮到調節pH 會增加試驗操作步驟，因此選擇pH=7 為最佳條件。

2.2 磁性材料用量及固相微萃取條件的交互影響

在極性溶液體系中，磁性納米材料在吸附雜質的同時也會吸附靶標農藥。本研究通過加入有機溶劑來平衡磁性材料對目標物的吸附與去除雜質之間的關系，以確定最佳分析條件。為此，采用正交試驗設計探討磁性材料用量、甲醇含量以及萃取時間對樣品基質中各農藥組分響應值的交互影響。以萃取溫度 (55±1) ℃、氯化鈉用量5%、pH=7、解析時間6 min 為固定條件，正交試驗設計如表2 所示，選取磁性材料Fe3O4-PSA 用量、甲醇含量和萃取時間3 個因素、4 個水平組合的L16(43)，測定在16 個試驗條件下各農藥組分的響應值，每個試驗3 次平行。

表2 Fe3O4-PSA 用量、甲醇含量、萃取時間L16(43)正交試驗表Table 2 Orthogonal experiments of Fe3O4-PSA dosage,methanol content, and extraction time L16(43)

16 組正交試驗中，分別將磁性材料Fe3O4-PSA 用量為0、10、20、30 mg 的條件找出并計算各組分峰面積的平均值K，進而計算極差R值和R平均值 (R-average) (見附表S1 ～ S3) 。R-average越大，表明該條件對結果影響越大。不同甲醇含量和萃取時間的R-average也同理可得。由表3 可知：主次順序為R-average (甲醇含量) >R-average(萃取時間) >R-average (Fe3O4-PSA 用量) ，因此甲醇含量和萃取時間是影響萃取效率的主要因素，不同組分隨甲醇含量和萃取時間變化的規律和程度不完全一致，根據不同條件下各農藥組分的響應平均值，發現當Fe3O4-PSA 用量0、甲醇含量0、萃取時間40 min 時萃取效果最佳，但鑒于Fe3O4-PSA 的添加可以減輕萃取纖維的損耗，并且Fe3O4-PSA 用量30 mg 時的萃取效果 (平均峰面積11 755 668) 僅次于不添加時的萃取效果 (平均峰面積12 476 695) ，因此選擇Fe3O4-PSA 用量30 mg、甲醇含量0 、萃取時間40 min 作為試驗條件。

表3 不同參數對茶飲料中各農藥組分響應值的影響Table 3 Effects of different parameters on the response values of pesticide components in tea drinks

2.3 方法確證

2.3.1 線性關系和基質效應 結果 (表4) 表明：在0.002 ～ 0.2 mg/L 范圍內，19 種三唑類農藥在茶飲料中均表現出很好的線性關系，相關系數(r)均大于0.99。以目標農藥3 倍信噪比所對應的濃度計算，檢出限(LOD)為0.000 12 ～ 0.008 9 mg/L。

基質效應可通過基質匹配標準曲線線性方程斜率和溶劑標準曲線線性方程斜率之比來評價。如果斜率比為1，說明不存在基質效應；斜率比小于1 為基質抑制效應；斜率比大于1 為基質增強效應。結果 (表4) 可見：19 種農藥均表現為基質抑制效應，其中硅氟唑、氟硅唑、粉唑醇、腈菌唑、環丙唑醇、已環唑、氧環唑、丙環唑、戊唑醇、糠菌唑、種菌唑和聯苯三唑醇存在明顯的基質抑制效應，說明在定量分析中基質影響較大，因此建議使用基質匹配標準溶液進行校正定量分析。

2.3.2 方法的準確度及精密度 在0.002、0.01 和0.02 mg/L 添加水平下，19 種三唑類農藥的平均回收率在71% ～ 98%之間，相對標準偏差 (RSD) 均小于16%。所有農藥組分的回收率都可滿足歐盟文件SANTE/12 682/2019[25]分析要求，表明本研究建立的方法可用于茶飲料中三唑類農藥殘留的分析。歐盟文件SANTE/12 682/2019[25]規定定量限（LOQ）為試驗中最低添加濃度水平，且回收率必須滿足試驗需求。本方法中最低添加水平為0.002 mg/L，回收率范圍為71%～98% (表5) ，故本方法19 種三唑類農藥的LOQ 為0.002 mg/L。

表5 19 種農藥在茶飲料中的回收率及相對標準偏差 (n=3)Table 5 The recoveries of 19 pesticides spiked in the tea drinks (n=3)

2.4 方法比對

為驗證本方法的適應性及有效性，將本方法與文獻報道的SPE 方法進行對比。按照試驗方法分別對15 mL 綠茶飲料中的三唑類農藥殘留進行分析，比對結果見附表 S4。在添加水平為0.01 mg/L時，本方法中84% 的農藥的回收率在80% ～110%之間，而SPE 方法中19 種農藥的回收率均低于80%。在有機試劑用量上，常規富集凈化方法有機試劑用量高達40 mL，而本方法中未使用有機試劑。在樣品處理速度上，現有文獻方法中涉及過柱及氮吹，耗時較長，而本方法經SPME直接富集萃取后上機檢測，方便快捷。因此，本方法在確保準確度的情況下，具有高效、快捷及環保等優勢。

2.5 實際樣品分析

隨機在零售超市購買綠茶飲料10 份，經本方法預富集與上機測試后，均未檢出本研究中涉及的19 種三唑類農藥。

3 結論與討論

本研究旨在利用具有凈化吸附功能的磁性納米材料及SPME 高效富集的功能，構建新型一體化、雙重凈化技術平臺。以茶飲料中19 種三唑類農藥為研究對象，采用磁性納米材料Fe3O4-PSA分別去除基質中的極性有機酸和茶多酚等雜質。在確定分析三唑類農藥的基礎SPME 條件后，利用正交試驗設計探討了Fe3O4-PSA 用量、萃取時間以及甲醇用量等影響因素，篩選出最佳的一體化分析方法條件。系統的方法確證試驗表明，在0.002 ～ 0.2 mg/L 范圍內，19 種三唑類農藥在茶飲料中均表現出很好的線性關系，相關系數均大于0.99，LOD 范圍為0.000 12 ～ 0.008 9 mg/L，LOQ為0.002 mg/L。采用基質匹配標準溶液進行樣品添加回收測定，結果表明，茶飲料樣品中三唑類農藥的回收率均可滿足分析測試要求。本方法簡單可行，能滿足日常生活中茶飲料中三唑類農藥的殘留檢測需求。此方法較常規法簡單、操作便捷、可靠，且環境友好，因為在前處理中省略了國標法中的有機溶劑處理程序，故不產生相應的有機廢棄物，同時也減少了很多一次性試驗用品的消耗，值得繼續完善并加以推廣。