吡唑醚菌酯在柑橘汁加工過程中的殘留動態(tài)

董 超, 趙其陽, 李 晶, 左 巍, 李志霞, 焦必寧

(西南大學(xué) 柑桔研究所, 重慶400712)

柑橘瘡痂病和柑橘炭疽病是柑橘生產(chǎn)過程中的兩種常見真菌性病害，嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。吡唑醚菌酯(圖式1)作為一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[3]，兼具殺菌和治療作用[4]，被廣泛應(yīng)用于柑橘中這兩種病害的防治，但已有報道稱其對于非靶標(biāo)生物表現(xiàn)出高毒性[5-6]。對于柑橘中農(nóng)藥殘留的風(fēng)險評估，往往主要關(guān)注農(nóng)藥在田間的殘留消解。如龍小方[7]的研究結(jié)果表明，吡唑醚菌酯在柑橘中的消解規(guī)律符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，半衰期為9.24～10.27 d；最終殘留試驗結(jié)果表明，柑橘全果(0.31 mg/kg)及果皮(1.45 mg/kg)中吡唑醚菌酯的最大殘留量遠(yuǎn)高于果肉(0.024 mg/kg)中的最大殘留量。隨著柑橘產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，柑橘逐漸被應(yīng)用于精深加工，衍生出多種加工產(chǎn)品。如NFC (not from concentrate) 果汁、柑橘皮精油等[8-10]，柑橘皮精油在食品加工中主要用作賦香劑，可使食品具有獨(dú)特的柑橘風(fēng)味，同時也具有一定的藥用價值，對多種病菌具有很強(qiáng)的抑制作用[11]。另外，一些副產(chǎn)物，如柑橘皮渣，主要由柑橘皮(約占60%～65%)、種子及絲穰組成[12]，可用于飼料產(chǎn)業(yè)及有機(jī)肥料產(chǎn)業(yè)[12-13]，從柑橘皮中提取的多種功能性成分(如辛弗林，橙皮苷)可用于醫(yī)療產(chǎn)業(yè)[14-15]。

目前，關(guān)于柑橘加工過程中農(nóng)藥殘留的研究報道較少。李云成等[8]研究了炔螨特在柑橘汁加工過程中的殘留行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炔螨特在柑橘皮精油中的殘留量顯著高于在其余加工產(chǎn)品中的殘留量。康霞麗等[16]研究了氟啶胺及阿維菌素在柑橘汁加工中的殘留量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種農(nóng)藥均在柑橘皮精油中富集，而在其余柑橘加工產(chǎn)品中的殘留量均有所下降，且榨汁是降低殘留最有效的方法。Cámara 等[17]在實驗室條件下模擬了幾種農(nóng)藥在橙汁商業(yè)化生產(chǎn)過程中的殘留行為，結(jié)果表明，幾種農(nóng)藥的殘留量在榨汁過程中均顯著降低。但尚未見吡唑醚菌酯在柑橘汁加工過程中殘留動態(tài)的報道。鑒于此，本研究利用HPLCMS/MS 建立了吡唑醚菌酯在柑橘加工產(chǎn)品及清洗液中殘留量的分析方法，并在重慶市江津區(qū)和湖南省洪江市兩地以普通甜橙為研究對象進(jìn)行田間施藥，然后按照商業(yè)化柑橘汁加工工藝進(jìn)行加工并測定其殘留量，以期明確吡唑醚菌酯在柑橘汁商業(yè)化加工過程中的殘留動態(tài)，為吡唑醚菌酯在柑橘加工食品中的安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6495 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS，美國Agilent 公司)；Sigma3-15K 臺式冷凍離心機(jī)(德國Sigma 公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；有機(jī)相針式過濾器(0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin) 標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，美國Sigma Aldrich 公司)；N-丙基乙二胺(PSA)，無水硫酸鎂、乙酸和氯化鈉(分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)。

1.2 田間試驗

田間試驗按照《加工農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[18]，于2019 年分別在湖南省洪江市和重慶江津區(qū)兩個柑橘產(chǎn)區(qū)進(jìn)行。供試作物為普通甜橙Citrus sinensis(L.) Osbeck。供試藥劑為40%吡唑 ? 咪鮮胺水乳劑，施藥劑量為5 倍最高推薦劑量(最高推薦劑量為有效成分33.3 mg/kg，田間施藥劑量為有效成分166.7 mg/kg)，以提高吡唑醚菌酯在甜橙中的殘留量。于甜橙成熟采摘前41 d 開始進(jìn)行噴霧施藥，共施藥3 次，施藥間隔期為10 d。于末次施藥后21 d 進(jìn)行采樣，每個試驗點(diǎn)選取約100 棵甜橙樹，將樹上無病蟲害的果實全部采收，取果量大于1.5 t，果實采收后立即加工。

1.3 果汁加工試驗

果汁加工試驗分別于2019 年12 月10 日(湖南試驗點(diǎn))和2019 年12 月15 日(重慶試驗點(diǎn))在國家柑桔工程技術(shù)研究中心中試車間進(jìn)行。加工工藝流程與橙汁商業(yè)化加工相同[16]，加工流程及取樣點(diǎn)見圖1。共設(shè)置9 個取樣點(diǎn)，包含原料果(全果、果肉)、清洗果(全果、果肉) 、初榨汁、精濾汁、NFC 果汁、濃縮汁、皮渣、油水混合物和皮精油9 種基質(zhì)樣品。

清洗與分級：先將洗果池和噴淋水池裝滿自來水，然后預(yù)浸泡果實，開啟鼓泡機(jī)進(jìn)行清洗，保持流水不斷進(jìn)入清洗池(多余的水從溢流口自動排出)，清洗5 min 后打開提升機(jī)并噴淋自來水。清洗后對果實進(jìn)行大小分級，以便于榨汁，提高出汁率。

榨汁：采用JBT 全果榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁，得到初榨汁，并在皮渣出口處隨機(jī)采集柑橘皮渣。

精濾：采用螺旋榨汁機(jī)完成。螺旋軸與機(jī)座之間形成可以調(diào)整大小的出渣口，可通過控制對物料的壓力大小來調(diào)節(jié)出汁率。

殺菌：精濾果汁經(jīng)過真空脫氣后于100 ℃下殺菌30 s，然后迅速冷卻至37 ℃左右，得到NFC果汁。

濃縮：采用三效四體降膜蒸發(fā)器對果汁進(jìn)行濃縮，濃縮一效溫度(即進(jìn)料溫度)為107 ℃，三效溫度(即出料溫度)為50～60 ℃，濃縮橙汁最終可溶性固形物含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%。

皮精油提取：在榨汁過程中用噴淋水對榨汁機(jī)進(jìn)行噴淋，得到油水混合物，先用轉(zhuǎn)速為7 402 r/min 的碟式分離機(jī)對油-水混合物進(jìn)行粗分離，然后用轉(zhuǎn)速為6 300 r/min 的離心機(jī)進(jìn)行精分離，得到柑橘皮精油。

每種加工產(chǎn)品采集3 個平行樣品，每份樣品約300 g，于 ?18 ℃保存。于2020 年1 月4 日進(jìn)行并完成樣品前處理步驟，并在前處理完成后24 h內(nèi)完成上機(jī)檢測。根據(jù)《植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲藏穩(wěn)定性試驗準(zhǔn)則》[19]，試驗樣品在30 d內(nèi)完成檢測，可不進(jìn)行儲藏穩(wěn)定性試驗，因此本研究未開展儲藏穩(wěn)定性試驗。

1.4 殘留分析方法

1.4.1 儀器分析條件

色譜條件： Agilent ecipse plus C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫40 ℃；流動相A 相為體積分?jǐn)?shù)0.1% 的甲酸水溶液，B 相為甲醇；梯度洗脫程序： 0～2 min，90%→10% A；>2～5 min，10% A；>5～5.1 min，10%→90% A；>5.1～6 min，90% A。

質(zhì)譜條件：正離子電噴霧離子源(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；干燥氣溫度250 °C；氮?dú)鈮毫?06.8 kPa；噴嘴電壓500 V；ifunnel 高200 V，低100 V；鞘氣溫度375 °C；鞘氣流速12 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥氣流速14 L/min；質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 吡唑醚菌酯的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of pyraclostrobin

1.4.2 樣品提取與凈化 準(zhǔn)確稱取5.0 g 柑橘加工樣品及清洗液樣品(精油樣品為2.5 g，提取前加入2.5 mL 水)于50 mL 離心管中，加入10 mL 提取劑(乙腈，含體積分?jǐn)?shù)1%乙酸)，超聲提取15 min 后，加入0.5 g NaCl 及2.0 g 無水MgSO4渦旋1 min，于10 000 r/min 下離心5 min；取2 mL 上清液至裝有50 mg PSA 的4 mL 離心管中，渦旋1 min，于3 000 r/min 下離心5 min；取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相針式過濾器過濾，即為空白基質(zhì)提取液，待測。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg 于20.0 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 000.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于 –20 ℃避光保存。用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.5、2.5、5、10 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，備用。

以空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.25 和0.5 mg/L 匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(精油基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.05、0.25、0.5 和1 mg/L)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 添加回收試驗 向空白基質(zhì)樣品中添加0.01、0.1 和2 mg/kg (精油基質(zhì)：0.2、2 和20 mg/kg)3 個水平的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個水平重復(fù)5 次，于室溫下靜置0.5 h 后按照1.4.2 節(jié)的方法進(jìn)行前處理，獲得樣品提取液后按照1.4.1 節(jié)的條件測定。測定前，將添加水平為2 mg/kg 的樣品提取液按V(空白基質(zhì)提取液) :V(樣品提取液)=3 : 1 進(jìn)行稀釋，添加水平為20 mg/kg 的樣品提取液按V(空白基質(zhì)提取液) :V(樣品提取液)=19 : 1 進(jìn)行稀釋，其余添加水平的樣品不再進(jìn)行稀釋。計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 加工因子計算

按《加工農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》方法[18]進(jìn)行。加工因子(PF)用于評估柑橘汁加工過程對吡唑醚菌酯殘留的影響，當(dāng)PF 大于1 時表明吡唑醚菌酯在該加工過程中殘留量升高，反之則表明殘留量降低。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測方法驗證

由表2 可知：在本研究的線性范圍內(nèi)，吡唑醚菌酯的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.990 5～0.999 9。

表2 吡唑醚菌酯在柑橘加工產(chǎn)品和清洗液中的線性關(guān)系Table 2 The linear relation of pyraclostrobin in citrus processing products and cleaning fluid

添加回收試驗結(jié)果(表3) 表明：在0.01、0.1 和2 mg/kg (皮精油基質(zhì)為0.2、2 和20 mg/kg)3 個添加水平下，吡唑醚菌酯在柑橘加工產(chǎn)品及清洗液中的回收率為63%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～9.6%。以最低添加水平為方法定量限(LOQ)，則吡唑醚菌酯在精油基質(zhì)中的LOQ為0.2 mg/kg，在其余基質(zhì)中的LOQ 為0.01 mg/kg。

表3 吡唑醚菌酯在柑橘加工產(chǎn)品和清洗液中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of pyraclostrobin in citrus processing products and cleaning fluid (n=5)

以上結(jié)果表明該方法符合農(nóng)藥殘留檢測的要求[20]，適用于不同柑橘加工產(chǎn)品及加工設(shè)備清洗液中吡唑醚菌酯殘留的檢測。

2.2 吡唑醚菌酯在柑橘加工產(chǎn)品中的殘留

2.2.1 試驗可行性驗證 為避免加工設(shè)備中的農(nóng)藥殘留影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，對加工設(shè)備進(jìn)行清洗，并采集各個采樣點(diǎn)的清洗液進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：清洗液中不含有吡唑醚菌酯殘留。此外，在柑橘加工當(dāng)日采集3 份未清洗的全果樣品進(jìn)行檢測，根據(jù)《加工農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》要求[18]，原料果中目標(biāo)農(nóng)藥的殘留量要大于10 倍LOQ 或者0.1 mg/kg。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重慶和湖南兩個試驗點(diǎn)的原料果中吡唑醚菌酯的殘留量均大于10 倍LOQ 和0.1 mg/kg (表4)，滿足開展加工殘留試驗的要求。

表4 吡唑醚菌酯在柑橘加工產(chǎn)品中的殘留量及加工因子Table 4 Residues and processing factors of pyraclostrobin in processed citrus products

2.2.2 吡唑醚菌酯在柑橘全果及果肉中的殘留

將原料果分別制成全果和果肉樣品，比較發(fā)現(xiàn)，柑橘果肉中吡唑醚菌酯的殘留量低于全果中殘留量的10%，表明吡唑醚菌酯主要?dú)埩粲诠ぶ小＝?jīng)清洗后，湖南和重慶兩試驗點(diǎn)柑橘全果中吡唑醚菌酯的殘留量分別減少了28%和39%，而果肉中吡唑醚菌酯的殘留量變化較小，可能是因為清洗過程可部分去除柑橘果皮表面的農(nóng)藥殘留，而難以去除果肉中的農(nóng)藥殘留[21]。清洗過程對于農(nóng)藥殘留的去除作用可能受清洗時間、清洗液的性質(zhì)(pH 等)、農(nóng)藥的理化性質(zhì)[辛醇/水分配系數(shù)(Kow)、溶解度及蒸氣壓]等因素影響[22-24]。邢峰等[24]研究了4 種農(nóng)藥在莼菜加工流程中的殘留行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莼菜中的農(nóng)藥殘留量隨著清洗時間的延長而逐漸降低，并在一定時間后相對穩(wěn)定。pH 值的改變往往影響農(nóng)藥的水解，進(jìn)而在一定程度上影響農(nóng)藥的殘留量，如二嗪磷在低和高pH 值條件下都會迅速水解，因為堿和酸均可催化其發(fā)生水解作用[25]。Chai 等[26]比較了不同溶劑的洗滌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用體積分?jǐn)?shù)10%醋酸水溶液清洗可有效去除黃瓜和草莓中的農(nóng)藥殘留，且農(nóng)藥的溶解度和蒸氣壓越高，越容易在清洗過程中被去除。Guardia-Rubio 等[27]研究了多種農(nóng)藥在橄欖上的殘留行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Kow 較低的農(nóng)藥易經(jīng)過清洗過程去除，如清洗過程對西瑪津(Kow 值為200) 的去除效果顯著好于對敵草隆(Kow 值為741)。一般而言，農(nóng)藥的Kow 值越高越容易進(jìn)入農(nóng)產(chǎn)品表面的蠟質(zhì)層，在清洗過程中不易被去除[13]。吡唑醚菌酯的Kow 值較高，屬于脂溶性農(nóng)藥，本研究中使用自來水清洗5 min 僅可去除部分農(nóng)藥殘留。而使用清洗劑則可能會導(dǎo)致清洗劑在加工產(chǎn)品中的殘留且可能會影響加工產(chǎn)品的品質(zhì)[28]。橙汁商業(yè)化加工中的清洗時間一般也為5 min 左右，延長清洗時間會降低生產(chǎn)效率并增大成本，而縮短清洗時間可能會增大農(nóng)藥殘留風(fēng)險，因此在后續(xù)的研究中可以綜合考察不同清洗時間的影響，從而為加工工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

2.2.3 吡唑醚菌酯在4 種柑橘果汁中的殘留 由表4 可知，初榨汁中吡唑醚菌酯的殘留量接近或低于0.01 mg/kg，低于原料果中殘留量的2%，可見榨汁過程可有效降低吡唑醚菌酯殘留，可能是由于吡唑醚菌酯在皮渣、果肉和果汁中的分配性質(zhì)具有差異，其殘留容易分布在皮渣和果肉中，而較難轉(zhuǎn)移到果汁中[29]。

初榨汁經(jīng)精濾得到精濾汁，精濾汁經(jīng)殺菌過程得到NFC 果汁。本研究中，精濾汁及NFC果汁中吡唑醚菌酯的殘留量均低于LOQ (0.01 mg/kg)，雖然殘留風(fēng)險較小，但難以判斷精濾及殺菌過程對于吡唑醚菌酯殘留量的影響。

湖南試驗點(diǎn)的濃縮汁中吡唑醚菌酯殘留量顯著高于精濾汁中的殘留量，可能是因為濃縮過程中水分的蒸發(fā)，而且吡唑醚菌酯的熱穩(wěn)定性較高，在濃縮過程中不易揮發(fā)和降解。本研究中，雖然濃縮汁中吡唑醚菌酯的殘留量有所升高，但也遠(yuǎn)低于原料果中的殘留量，而且濃縮汁一般用于市售果汁的生產(chǎn)，在生產(chǎn)過程中還會進(jìn)行稀釋，從而使吡唑醚菌酯殘留量進(jìn)一步下降[16]。

2.2.4 吡唑醚菌酯在柑橘皮渣中的殘留 湖南和重慶2 個試驗點(diǎn)柑橘皮渣中吡唑醚菌酯的殘留量均高于原料果中的殘留量(表4)，產(chǎn)生了富集效應(yīng)，因此在綜合利用皮渣時應(yīng)重視農(nóng)藥殘留風(fēng)險。毛雪飛[30]研究了清洗、干燥和發(fā)酵3 種方式對皮渣中農(nóng)藥殘留的去除作用，結(jié)果表明，超聲清洗、微波干燥以及發(fā)酵均可有效去除農(nóng)藥殘留。

2.2.5 吡唑醚菌酯在柑橘皮精油中的殘留 本研究中，吡唑醚菌酯在柑橘皮精油中的殘留量顯著高于原料果中的殘留量(表4)，可能是因為柑橘皮精油富含的活性成分d-苧烯(d-limonene)具有良好的溶解性，使農(nóng)藥易穿過果皮表層而殘留于果皮組織中，從而導(dǎo)致皮精油中農(nóng)藥殘留量顯著增加[31]。Li 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，脂溶性農(nóng)藥易在精油中富集。吡唑醚菌酯是一種脂溶性農(nóng)藥，在精油中易于富集，因此應(yīng)重視其殘留風(fēng)險，在加工前可通過監(jiān)測原料果中的殘留量，在加工后可以通過蒸餾、吸附等途徑降低其殘留。

2.3 柑橘加工產(chǎn)品中吡唑醚菌酯的加工因子最佳評估值

參考Li 等[32]的方法，采用加工因子的最佳評估值(best estimate)整體評價柑橘汁加工過程對于吡唑醚菌酯殘留的影響。根據(jù)《農(nóng)藥殘留加工因子手冊》[33]，加工因子的最佳評估值可采用其最大值、平均值或者中值。本試驗基于2 個試驗點(diǎn)的PF 數(shù)據(jù)，采用平均值作為其最佳評估值。結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)：吡唑醚菌酯在柑橘皮精油和果渣中的PF 最佳評估值均大于1，表明吡唑醚菌酯在柑橘皮精油和果渣中易于富集；而在其余加工產(chǎn)品中的PF 最佳評估值均小于1，尤其在初榨汁中的PF 最佳評估值為<0.02，表明其余加工過程均可降低吡唑醚菌酯的殘留量，且榨汁是降低吡唑醚菌酯殘留的高效途徑。

3 結(jié)論

柑橘榨汁過程是降低吡唑醚菌酯殘留的高效途徑，初榨汁中吡唑醚菌酯殘留量低于其在原料果中殘留量的2%。吡唑醚菌酯易在果渣(PF 的最佳評估值為1.2) 和精油(PF 的最佳評估值為15.6)中富集，在后續(xù)利用過程中應(yīng)考慮其農(nóng)藥殘留風(fēng)險。