宏基因組學測序技術在肝硬化膿毒癥中的應用

貝小歌， 陳金軍， 黎倍伶

南方醫科大學南方醫院 肝病中心， 廣州 510515

肝臟結構破壞、系統免疫失調以及內在和外周血流動力學異常導致肝硬化患者比普通人群容易發生感染，進展為膿毒癥比例更高[1]。據統計，25%～40%肝硬化住院患者存在細菌感染[2]，若發生膿毒癥，肝硬化患者的死亡率將增加4倍[3]。耐藥病原體的出現、對疾病的認識不足及診斷延誤是導致膿毒癥高死亡率的常見原因[4]。精準抗生素治療依賴于致病病原體的早期識別。近年來，宏基因組學測序技術(metagenomic next generation sequencing，mNGS)作為分子診斷的新技術，已成為檢測和鑒別臨床樣本中微生物的有效方法，在膿毒癥的診療中廣泛應用[5]。本文將總結肝硬化相關膿毒癥的發病機制和診療的最新進展。

1 肝硬化膿毒癥發生機制

1.1 肝硬化免疫缺陷 肝硬化是一種以多方面免疫功能障礙為特征的終末期器質性疾病。持續性免疫系統刺激和進行性免疫缺陷會引起肝硬化相關免疫功能障礙，增加死亡風險[6]。肝硬化相關免疫功能障礙狀態在先天性和適應性免疫障礙方面已被廣泛描述。Lebossé等[7]首次報道了肝硬化患者在循環系統中表達免疫抑制性HLA-DR的CD8+T淋巴細胞亞群的擴增，該亞群會增加感染的易感性并與疾病不良預后相關。既往研究[8]發現，慢性肝病患者中MERTK+單核細胞數量會增加并將抑制對微生物的先天性免疫應答，中性粒細胞的抑菌活性和殺菌蛋白的釋放在酒精性肝硬化患者中受到嚴重損害[9]。肝硬化患者最常見的感染類型是腹腔感染，包括自發性細菌性腹膜炎和細菌性腹水[10]。有研究[11]指出腹水的中性粒細胞比外周血中性粒細胞的吞噬和氧化爆發率分別下降50%和70%。

1.2 腸道菌群移位 肝臟的解剖位置和血液供應經常使肝臟暴露于腸道來源的細菌及其產物。肝硬化出現感染與腸道穩態的變化有關，包括腸道通透性增加、運動減少、菌群紊亂和小腸細菌過度生長[12]。健康人群中，腸腔中的微生物與黏膜相互作用，形成黏液[13]，不僅吸收營養物質，還阻隔病原微生物、毒素等有害物質的入侵。在肝硬化失代償期，門靜脈高壓會導致腸道水腫，表現為組織缺氧和細胞間上皮間隙擴張[14]。另外，某些炎癥因子(例如TNFα)則可以通過下調緊密連接蛋白和抗生素凝集素來降低腸屏障的完整性[15]。所以，肝硬化腸道炎癥和門靜脈高壓都使腸道通透性增加，均為菌群移位的基礎。腸道屏障通透性增加會使細菌片段或病原體相關分子模式(例如脂多糖、鞭毛蛋白或肽聚糖)移位至血液中，激活免疫系統。另一方面，晚期肝病患者常出現胃腸動力障礙，小腸輸送時間延長與小腸細菌過度生長有明確的相關性[16]。酒精、病毒、藥物的使用等各種刺激因素也會加劇腸道菌群紊亂。許多研究[17]已證實，腸道微生物群豐度及組成在肝硬化病情進展過程中發生明顯變化。

1.3 肝硬化全身性炎癥 肝臟是調節免疫系統動態平衡和防御感染的重要器官，肝臟中30%的細胞成分(包括內皮細胞、淋巴細胞、Kupffer細胞和膽管上皮細胞)負責器官免疫功能。肝硬化的發生導致肝臟免疫系統的動態平衡被打破，其抗感染的功能隨之受到影響。肝硬化患者發生感染時，其全身性炎癥主要是通過所有先天性和適應性免疫細胞的活化來介導的。內皮細胞是肝損傷早期反應的第一道防御屏障，激活的內皮細胞將上調黏附分子的表達，誘導有關促炎反應的細胞因子、趨化因子、細胞因子的分泌[18]。而Kupffer細胞是肝臟中第一個與腸道細菌接觸的免疫細胞，它能激活肝星狀細胞，進而募集成纖維細胞并啟動肝纖維化[19]。與健康者相比，肝硬化患者的促炎細胞因子顯著升高，包括IL-6、IL-8、TNFα等，并且全身性炎癥強度與慢加急性肝衰竭的嚴重程度相關[20]。在代償性肝硬化中，損傷的肝細胞會釋放損傷相關的分子模式，激活免疫系統，誘發全身性炎癥，導致肝內肝外的器官損傷或衰竭。

總之，即使沒有感染，代償性肝硬化也處于全身持續炎癥狀態，失代償性肝硬化則表現出更高的炎癥水平。在失代償期肝硬化中，門靜脈高壓的惡化會導致細菌移位，使病原體相關分子模式從腸腔釋放入循環系統。肝硬化和慢加急性肝衰竭患者由于持續暴露于損傷相關的分子模式和病原體相關分子模式，最終會導致肝硬化相關免疫功能障礙，即全身性炎癥與免疫抑制共存的狀態。肝硬化相關免疫功能障礙狀態增加了肝硬化患者對感染的敏感性。細菌移位所致的菌血癥以及細胞免疫受損與膿毒癥發生率增加有關。

2 膿毒癥診療

2.1 膿毒癥的全新定義 膿毒癥-3(sepsis 3.0)的定義為宿主對感染反應失調引起的致命性器官功能障礙。診斷標準為感染引起的序貫性器官功能衰竭評價(sequential organ failure assessment, SOFA)評分≥2分，即“膿毒癥=感染+SOFA≥2”，并衍生出快速SOFA(quick SOFA，qSOFA)評分作為膿毒癥篩查的主要工具[21]。膿毒癥-3的定義強調了非穩態宿主對感染的反應以及對緊急識別的需求，系統的評分標準也便于臨床醫生對膿毒癥盡早地診斷和治療。

2.2 早期識別和治療膿毒癥的重要性 目前尚無經許可用于膿毒癥的藥理學治療方法，但早期使用有效的抗生素可以降低死亡率[22-23]。研究發現，抗生素治療延遲12 h的患者院內死亡率為28%，而在1 h內接受抗生素治療的院內死亡率減少為23%[24]，膿毒癥患者每延遲1 h使用抗菌藥物，將增加8%感染性休克的風險[25]。因此，“存活膿毒癥”運動指南建議在1 h內進行抗生素治療，而且要在抗生素治療前進行血液培養[26]。

最近多個全球性前瞻性研究[27-28]發現，肝硬化血流感染中耐多藥菌達三分之一。 耐藥病原體會嚴重影響到抗生素的治療效果。不恰當的抗生素治療已證實與膿毒癥死亡率增加有關[29]。不合適的抗生素使用將導致膿毒癥患者生存率降低5倍[30]。但也有學者[31]質疑目前抗生素的濫用，并提出應該基于病原體的檢測，進行精準的抗生素治療。因此，需要改進膿毒癥的診斷手段，從而指導抗生素的使用。

2.3 傳統診斷技術的局限性 體液樣本的培養技術目前仍然是診斷感染和膿毒癥的金標準[32]。然而，培養技術有許多缺點，例如培養周期時間長 (微生物需要6 h～5 d才能培養至可檢測水平，測試抗生素敏感性需要額外24～48 h)、低靈敏度、大樣本量、頻繁重復檢測、抗生素治療后的假陰性結果風險(30%～63%)增高等[33]?；谂囵B結果的診斷過程是非常緩慢的，往往需要實驗室檢查來輔助診斷膿毒癥。目前研究較多的生物學標志物一般與炎癥機制有關，它們還能用于評估療效和預后。通常包括CRP、降鈣素原、前胰蛋白酶、IL-6、脂多糖結合蛋白、中性粒細胞CD64等[33]。在SOFA評分的基礎上增加CRP、WBC等生物學標志物的檢測可以提高評估預后的價值[34]。但是，生物學標志物在非感染性疾病中也會異常升高，無法區分感染源性和非感染源性炎癥，也就不能可靠地鑒別感染的存在和判斷疾病的嚴重程度。因此，上述標志物未能在臨床上廣泛使用。

2.4 mNGS應用于膿毒癥診斷 有效的診斷學方法應能快速而廣泛地檢測病原體，同時能檢測病原體的耐藥性。Palacios等[35]及Xu等[36]分別于2008年、2011年首次運用mNGS在臨床病例中檢測出新型沙粒病毒、新型布尼亞病毒，開啟了mNGS技術在感染中的應用。mNGS的出現克服了培養技術的局限性，廣泛應用于遺傳病、腫瘤、感染性疾病?；蚪M學主要分析體細胞中的遺傳物質，可以通過整個個體基因組的外顯子編碼區或常見的單核酸多態性來進行測量[37]。其中，運用PCR分析16S rRNA的方法已被用于細菌感染物種/屬水平的鑒定。

與培養技術相比，mNGS的優勢顯而易見。Rozo等[38]觀察了200例膿毒癥患者，結合培養、血清學、PCR、mNGS診斷方法，46.5%患者找到了致病原因，證明了基于mNGS的檢測可以對一些培養陰性、缺乏配對血清學分析的恢復期血清標本，或其他傳統方法無法診斷的患者進行診斷。Grumaz等[39]更是發現mNGS的陽性率比血培養高6倍以上，96%的mNGS診斷結果為可信的，53%的mNGS診斷結果將改變抗生素治療方案。Grumaz等[40]還證實基于cfDNA的mNGS完整工作流程在大約30 h內完成，可以在較短時間內作出有效治療干預。因此，mNGS可能為優化肝硬化膿毒癥診斷和治療的有效手段。

早期識別和治療對于減少并發癥和降低死亡率至關重要?；诮M學的方法有助于膿毒癥的快速病因診斷，在樣本收集后僅幾個小時就能做出臨床決策。也許在未來可以將膿毒癥管理限制在有效的治療時間窗內。然而，受限于昂貴成本、報銷制度未完善、測序結果判讀的復雜性、樣本污染和定植菌等影響因素[41]，目前mNGS還不能替代傳統的微生物檢測方法。該技術如果能突破成本、技術平臺、敏感度等局限性，未來有望成為臨床一線檢測手段。

3 總結

肝硬化患者免疫功能缺陷，腸道菌群移位嚴重，感染后容易發生膿毒癥。目前膿毒癥的診斷主要基于常規的臨床實驗室指標，其病原體診斷主要依賴于培養，但培養時間長、陽性率低，限制了膿毒癥患者的早期診斷和治療。mNGS可提高病原體的檢出，可能為優化膿毒癥病原體診斷的有效手段。肝硬化膿毒癥未來治療方向可能從以下幾點進行干預：疾病早期，提高對病原體的識別能力；疾病中期，抑制快速發展的炎癥反應；疾病晚期，改善免疫功能并消除免疫抑制狀態。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：貝小歌負責擬定寫作思路，撰寫論文；陳金軍、黎倍伶參與修改論文，指導撰寫文章并最后定稿。