腸道菌群在代謝相關脂肪性肝病中的作用

楊禮丹， 何 訸， 安振梅

四川大學華西醫院 a.實驗醫學科， b.內分泌代謝科， 成都 610041

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)全球患病率高達25%，嚴重危害人類健康，并對社會造成巨大經濟負擔[1]。NAFLD患者肝脂肪變性向脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)的轉變是引起肝硬化、肝細胞癌和肝移植的主要原因之一[2]。2020年初，國際專家小組發布共識聲明[3]，將NAFLD更名為代謝相關脂肪性肝病(metabolism-related fatty liver disease, MAFLD)。這一更名有利于將其他慢性肝病患者(合并或不合并代謝異常)進行明確區分，同時也強調了代謝因素在慢性肝病診斷和治療過程中的重要性。以下關于NAFLD的論述均替換為MAFLD。MAFLD是由多種代謝、環境、遺傳和微生物機制介導的復雜疾病，與之相關的致病因素包括遺傳(如PNPLA3基因多態性)、飲食(如果糖)、胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和脂肪因子[4-5]。其他可能與MAFLD相關但還需要進一步研究的致病因素，目前關注較多的是內分泌干擾物和腸道菌群[6]。本文就腸道菌群在MAFLD中的作用及機制的研究進展作一綜述。

1 腸肝軸

腸肝軸是指胃腸道和肝臟之間緊密的解剖學和功能關系。在包括NASH和肝硬化在內的多種臨床相關疾病中，腸道通透性和微生物組組成及代謝的變化，均可能導致腸道菌群-腸屏障-肝臟這一軸線發生變化[7]。人類腸道菌群主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成。變形桿菌門、疣微菌門、放線菌門、梭桿菌門和藍細菌比例較少。從空腸到結腸，細菌的數量和多樣性增加，并且主要細菌種類發生了變化[8]。在食道和近端小腸，鏈球菌屬占優勢，而在結腸中，厚壁菌門和擬桿菌門最為普遍[9]。腸道菌群受外源性(飲食習慣、食物纖維、不易消化的碳水化合物、生活方式、藥物等)和內源性(細菌黏膜受體及其相互作用、腸道pH、免疫應答等)因素的影響[10]。細菌和病原體相關分子模式易位是肝病發生的重要病理生理過程[11]。大量研究表明，患有酒精性肝病或肝硬化的患者其腸道通透性增加，這可能是引起疾病進展的重要因素[12]。

2 MAFLD中腸道菌群種類的變化

MAFLD的危險因素(如飲食、肥胖和IR)均與腸道微生物有關[13-14]。將MAFLD小鼠的腸道菌群移植到無菌小鼠，發現腸道菌群在MAFLD的發生發展中起著重要作用[15]。Zhu等[16]通過16S核糖體RNA基因測序的方法比較了NASH、肥胖和健康兒童腸道菌群在門、科和屬水平上的差異情況，結果顯示健康受試者與肥胖患者(有或沒有NASH)之間腸道菌群種屬差異較大，而肥胖組和NASH組患者腸道菌群組成差異較小；與健康組相比，肥胖組和NASH組擬桿菌門比例增加，厚壁菌門比例減少；變形菌門的比例在健康組、肥胖組和NASH組中依次增加，而放線菌門的豐富度則依次減低；變形桿菌、腸桿菌科和埃希氏菌是在肥胖組和NASH組之間表現出顯著差異的門、科和屬類型，三者在NASH組中比例明顯升高。Boursier等[17]對57例活檢證實為MAFLD患者的糞便樣本進行16S核糖體RNA基因測序，發現NASH與擬桿菌屬增多有關，而瘤胃球菌增多則與晚期纖維化(≥F2纖維化期)有關。Tomas等[18]研究發現高脂飲食(high-fat diet, HFD)誘導的肥胖小鼠腸道厚壁菌門、變形菌門比例增高，而擬桿菌門比例降低，抗菌肽分泌減少，腸道通透性增加，回腸分泌黏液減少，這一系列變化引起腸道黏膜免疫防御功能減低。進一步研究發現這一改變主要通過HFD下調過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ表達實現，而加入PPARγ的特異性激動劑(羅格列酮)后，腸道黏膜防御功能得到改善。Turnbaugh等[19]通過將人類糞便移植到小鼠體內使小鼠的腸道菌群人源化，然后以高脂、高糖飲食(“西方飲食”)或植物性低脂飲食喂養小鼠，結果發現與飼喂植物性飲食的小鼠相比，飼喂高脂肪飲食的小鼠腸道菌群中擬桿菌門比例減低，而厚壁菌門比例增高。目前已有的研究均顯示在超重或肥胖的人群或小鼠中，厚壁菌門與擬桿菌門比值增加，體質量減輕時伴隨厚壁菌門與擬桿菌門比值降低。

3 腸道菌群代謝產物與MAFLD

3.1 短鏈脂肪酸(SCFA) 腸道細菌對膳食纖維的發酵是SCFA的主要來源，包括瘤胃球菌屬、沙門氏菌屬、鮑氏菌屬、真桿菌屬、無氣溶膠菌屬、糞球菌屬、糞桿菌屬等。SCFA通過門靜脈吸收并輸送至肝后，參與MAFLD的發生與發展。SCFA包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等，丁酸鹽是結腸細胞營養的主要來源。有研究[20]表明丁酸酯可參與調節腸屏障的完整性及增強屏障功能；丙酸酯補充劑可顯著減輕體質量和減少肝內脂質含量，防止胰島素敏感性進一步減低，并刺激人結腸細胞釋放多肽-YY和胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)。動物實驗[21]表明，產丁酸鹽的益生菌糾正了小鼠HFD引起的腸肝免疫失調和NASH，這一作用由SCFA所介導。SCFA主要通過激活G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor, GPR)41/43或通過抑制組蛋白脫乙酰基酶(histone deacetylase, HDAC)發揮其生物學功能。GPR41和GPR43的激活可以防止HFD誘發的肥胖、IR和血脂異常，部分與其促進GLP-1的產生并增加能量消耗有關[22]。補充丁酸酯(SCFA中HDAC的有效抑制劑)可以減輕HFD誘導的NASH，其潛在機制與改善腸道菌群失調和改善胃腸道屏障有關，進而抑制了腸道來源的內毒素向肝臟的輸送[23]。

3.2 支鏈氨基酸(BCAA) BCAA由結腸中的細菌水解發酵蛋白產生，包括梭菌屬、擬桿菌屬、放線菌屬、丙酸桿菌屬和鏈球菌屬等[24]。MAFLD患者血液和尿液中的BCAA(包括亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)水平升高[25]。BCAA水平的增加與BMI的增加相關[26]。BCAA可降低機體對病原體的敏感性，改善免疫功能，促進腸道有益細菌生長和增強腸道屏障功能[27]。血液循環中的BCAA水平與肝胰島素敏感性呈負相關，研究[28]認為基線纈氨酸水平可預測肝脂肪堆積。進一步的動物實驗[29]表明，補充BCAA可以減輕HFD引起的超重，但其對HFD小鼠造成明顯的肝損害，這可能與脂解異常有關。另有一些研究[30-31]表明，BCAA干預可減輕動物模型中的NASH。這提示關于BCAA在代謝性疾病中的確切作用有待進一步研究。

3.3 膽汁酸 膽汁酸不是由腸道菌群直接產生，但其可被腸道菌群代謝(解偶聯和去羥基化)，是肝臟與腸道之間關聯的重要物質。膽汁酸的腸肝循環對脂質和葡萄糖代謝具有一定的生物學功能，并與NASH的發病機理和治療有關。特定膽汁酸與NASH的組織學特征之間有一定關系，例如共軛膽酸和牛磺膽酸的含量與NAFLD活性評分(NAFLD activity score, NAS)呈負相關[32]。在應用丹寧片(調節膽汁酸代謝的中藥)治療MAFLD的早期臨床試驗[33]中，服藥3個月后，患者的臨床癥狀、血清ALT水平、血脂狀況和超聲下的脂肪肝嚴重程度均得到了明顯改善。膽汁酸可通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的激活誘導肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)增殖而出現纖維化，而HSC可排出膽汁酸，進而抑制由膽汁酸誘導的細胞凋亡[34]。某些膽汁酸也可通過激活EGFR來調節人腸道單層上皮細胞的緊密連接結構和屏障功能，進而增加腸道通透性，促進肝纖維化的發生[35]。此外，膽汁酸是法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor, FXR)的配體，FXR介導的信號傳導對肝脂質和碳水化合物的代謝具有有益作用，并且該信號傳導途徑還調節肝臟中主要的膽汁酸合成。親脂性膽汁酸與FXR結合后，促進胰島素敏感性，并減少肝糖異生和循環甘油三酯[36]。值得注意的是，HFD飼喂的MAFLD小鼠模型中，FXR通過調控腸道微生物群的腸道拮抗作用引起肝脂肪生成減少[37]。

3.4 內毒素和乙醇 IR是MAFLD發病的重要因素，且全身低炎癥狀態與IR有關。革蘭陰性菌源性內毒素如脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)可刺激和加重肝壞死性炎癥。當肝臟Kupffer細胞暴露于細菌LPS時，將通過激活Toll樣受體、髓樣分化因子88和核因子-κB的途徑釋放促炎細胞因子，其可激活HSC和纖維形成[38]。

乙醇是可導致肝脂肪變性和炎癥發生并增加肝纖維化、肝細胞癌風險的物質。細菌發酵產生的內源性乙醇(主要是瘤胃球菌屬)刺激MAFLD的氧化應激并加劇肝臟炎癥，這在動物實驗中得到了證實[39]。部分臨床研究中內源性乙醇的作用并未得到一致結果，但其可能在NASH的發病機理中起著關鍵作用。

3.5 細菌膽堿代謝產物——三甲胺(TMA) 膽堿因其在預防MAFLD中的生理作用被列為必需營養素，膽堿缺乏飲食廣泛應用于NASH動物模型[40]。機體主要從飲食中獲得膽堿，膽堿可被腸道菌群(包括彭氏變形桿菌、大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌等)切斷碳氮鍵代謝為TMA[41]。TMA通過門靜脈進入肝臟，并被肝臟含黃素的單氧化酶氧化成三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide, TMAO)。一項臨床研究[13]發現，血液循環中的TMAO水平與MAFLD的嚴重程度呈負相關。血清TMAO水平隨BMI升高而升高，并與脂肪肝指數密切相關[42]。給HFD喂養的小鼠補充TMAO可以減輕糖耐量受損情況，增加胰島素分泌，因此，TMAO對MAFLD的影響可能是一把雙刃劍。此外，TMAO可以通過影響膽固醇的轉運而降低膽汁酸的合成，從而減少極低密度脂蛋白的產生[43]。

4 腸道菌群聯合多組學分析

鑒于全球范圍內MAFLD的高發病率及其與腸道菌群的緊密聯系，針對微生物組的研究為MAFLD發病機理及診斷和治療提供了巨大的機遇和挑戰。之前的大多數研究都采用16S rRNA測序技術，該技術只能提供微生物組成信息，因此必須使用高精度的宏基因組學測序技術在菌株水平上鑒定與MAFLD相關的微生物，該技術還可以提供腸道微生物組的功能信息。此外，隨著高通量測序技術的發展，基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等也已經成為人們發現生命化學物質的基礎和深入了解其分子機制的新方向。通過對多組學數據的整合分析，利用組學間的交叉互補，能更系統地在分子層面幫助研究腸道菌群與MAFLD之間的相互作用及機制。

多組學聯合分析，不僅被用于研究MAFLD的分子機制，也已用于篩選非侵入性診斷標志物，預測疾病嚴重程度，甚至用于新藥的評估等[27,44]。例如，基因集富集分析為基因組數據領域提供了關于酒精性和非酒精性肝病之間共享疾病通路的新知識[45]。同樣，基因組數據的整合也強調了代謝綜合征和MAFLD的共同遺傳基礎[46]。代謝物集富集分析是基因富集的代謝組學對應物,該分析可通過商業軟件或免費軟件運行，已被應用于證明MAFLD相關代謝途徑的改變[47]。Del Chierico等[48]使用宏基因組學和代謝組學分析證明了顫螺旋菌屬的減少伴隨著2-丁酮水平上調，以及瘤胃球菌屬的增加是MAFLD發病和MAFLD向NASH進展的標志。Lovric等[49]通過炎癥相關的蛋白質組學、脂質組學和代謝組學聯合分析，確定了一系列參數的獨立作用，包括MAFLD男性患者心肌脂肪、心外膜脂肪、心包脂肪和肝脂肪中與炎癥相關的血漿蛋白以及血漿脂質和代謝物的特征。Hoyles等[25]將糞便宏基因組學和肝轉錄組學、血漿和尿液代謝組學結合起來，揭示了非糖尿病肥胖女性中連接腸道微生物組和宿主表型與肝脂肪變性的分子網絡，發現脂肪變性患者的微生物組基因豐富度較低，并且在以下幾個方面表現出遺傳潛力增加：膳食脂肪處理、內毒素生物合成(特別是變形桿菌)以及出現芳香族和BCAA的代謝紊亂等。研究者進一步通過細胞及動物實驗證明了糞便微生物菌群移植和長期苯乙酸(芳香族氨基酸的微生物產物)治療可以引起脂肪變性和觸發BCAA代謝。此外，研究者通過整合宏基因組學、轉錄組學和代謝組學的信息建立并驗證了一個預測肝脂肪變性的多元模型(AUC=87%)，與腸道微生物對脂肪變性的影響相一致，進一步提示微生物移植療法的可行性。預計在不久的將來，MAFLD患者可以根據其“分子特征”進行診斷和治療。

5 小結

MAFLD的發生、發展原理雖然已被廣泛研究，但其機制尚未完全闡明。由腸道菌群失調、腸道屏障改變、腸道代謝產物紊亂和細菌易位引起的腸肝軸改變，可觸發肝臟炎癥和形成原纖維，最終導致MAFLD向NASH、肝硬化發展。此外，腸道菌群及其代謝產物也有望成為MAFLD的非侵入性診斷標志物，用于疾病早期診斷和對疾病嚴重程度的評估。無論是作為診斷標志物還是治療靶點，腸道菌群及其代謝產物在MAFLD中的作用都值得更深一步研究，以期在精準醫療體制下更全面地了解影響人類代謝疾病的微生物因素，從而為腸道菌群靶向移植治療和肝臟代謝穩態藥物研發奠定基礎。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：楊禮丹負責課題設計，資料分析，撰寫論文；何訸參與修改論文；安振梅負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。