轉錄激活因子3與慢性肝臟疾病相關性的研究進展

辜群利, 李 暉, 鄧秀秀， 曾子鍵， 董海艦

1 成都中醫藥大學附屬醫院 中心實驗室， 成都 610072；

2 成都中醫藥大學臨床醫學院， 成都 610072

肝臟疾病涉及的組織與細胞類型復雜多樣，目前認為細胞信號轉導與基因表達的異常是其重要的分子機制。在眾多信號分子中，轉錄因子能夠直接調節基因表達，在調節細胞功能與疾病進展中發揮關鍵作用。轉錄激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是一種應激誘導的適應性反應基因[1]，作為信號中樞與肝細胞和肝星細胞相互作用引起一系列生物活性的變化。然而，關于ATF3在肝臟疾病中的表達和功能的報道很少，其在肝臟中作用機制尚不明確，本文將對ATF3與慢性肝臟疾病中的相關性進行綜述，以期尋找新的潛在治療靶點。

1 ATF3概述

典型ATF3最初是從血清誘導的HeLa細胞中分離出來的，它編碼181個氨基酸，分子量為22 kDa，是ATF/cAMP反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)家族的一員，它以共有序列TGACGTCA與許多啟動子中的環腺苷酸反應元件(CRE)結合。ATF3已在不同的細胞系統中鑒定出五種選擇性剪接亞型，包括ATF31zip、ATF31zip2 (ATF31zip2a和ATF31zip2b)、ATF31zip2c、ATF31zip3、ATF3b，在功能上，除了ATF3b，其他亞型(亮氨酸拉鏈結構域缺陷)不能結合DNA并抵消標準ATF3的轉錄抑制[2]。

ATF3的表達和功能取決于其受到的誘導信號及其相互作用蛋白等多種因素的影響。在生理條件下，ATF3的表達受到包括脂肪因子、趨化因子、細胞因子、缺氧和化療藥物等多種應激信號的刺激[1,3-8],這些細胞外信號激活ATF3誘導表達如NF-κB、Smad、ERK、TGFβ、JNK和p38等信號通路[9-10],從而引起一系列細胞生物學變化。ATF3在細胞對壓力的反應中起著重要的作用，通過修復DNA損傷來緩解應激,而通過抑制Id-1和調節p21、p53、細胞周期蛋白控制細胞周期來影響細胞凋亡[11-12]。ATF3 可與自身結合形成同源二聚體對靶基因啟動子發揮轉錄抑制作用,也可與其他ATF/CERB家族蛋白或CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)家族蛋白合作形成異源二聚體，根據細胞和啟動子的不同條件發揮轉錄抑制或轉錄激活雙向調節作用[13]。

ATF3的活性還受翻譯后修飾(post translational modifications，PTM)的調控，ATF3被認為是許多細胞轉導過程中的樞紐，具有許多潛在的PTM位點。它有1個酪氨酸、21個絲氨酸/蘇氨酸和17個賴氨酸殘基，這是最常見的修飾氨基酸[1]，在所有預測的PTM中，實驗分析表明ATF3經歷了磷酸化、乙?；头核鼗?。

2 ATF3在肝臟代謝中的作用

2.1 ATF3調節肝臟葡萄糖代謝 ATF3參與多種器官和組織的葡萄糖代謝，包括胰腺、肝臟、脂肪組織、下丘腦和心臟。研究[14]發現，在轉甲狀腺素運載蛋白(transthyretin,TTR)啟動子驅動的肝臟和胰腺中過度表達ATF3的轉基因小鼠表現出葡萄糖穩態失調和圍產期致死率升高，并證明ATF3在肝臟中的表達抑制了編碼糖異生酶如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和果糖-1、6二磷酸酶的基因表達。此外，TTR-ATF3轉基因小鼠表現出肝功能障礙的跡象，如血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、膽紅素和膽汁酸增加[15]。

最近研究發現ATF3在乙醇介導的降糖作用中起關鍵作用。乙醇的攝入很可能是一種應激信號，會增加胰腺和肝臟中ATF3的表達。使用小干擾核糖核酸靶向破壞ATF3導致酒精依賴性β細胞功能障礙的逆轉，以及葡萄糖激酶和胰島素上調[16]。ATF3與β細胞中的胰腺和十二指腸同源盒因子-1(pancreatic and duodenal homeobox factor-1,PDX-1)啟動子結合并抑制其轉錄，從而提供了ATF3改變葡萄糖穩態的額外機制[17]；同樣，乙醇消耗后ATF3的增加導致PDX-1與葡萄糖激酶啟動子的結合減少[16-17]。乙醇還通過減少CREB及其輔激活劑CREB調節轉錄輔激活劑2向糖異生基因啟動子的募集并抑制其表達來降低空腹血糖水平；而ATF3沉默逆轉了禁食小鼠和培養肝細胞中乙醇的這些效應，證明了CREB和CREB調節轉錄輔激活劑2對糖異生啟動子的募集依賴于ATF3[18]。

ATF3還可以通過防止促凋亡基因信號轉導與轉錄激活因子1(signal transducerand activator of transcription 1,STAT1)在肝細胞的泛素化和蛋白酶體降解來穩定STAT1，從而促進鏈脲佐菌素誘導的糖尿病損傷[19]。

2.2 ATF3調節肝臟脂肪代謝 ATF3在肥胖小鼠的白色脂肪組織中上調，ATF3可下調CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alphal,C/EBPα)或過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated reeptor γ, PPARγ)的表達，抑制脂肪細胞分化[20-22]。以往有研究發現ATF3負性調節脂聯素基因及其受體的表達。Jang等[20]證明ATF3參與了脂肪細胞缺氧調節的肥胖線粒體功能障礙，線粒體相關基因如核呼吸因子1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α、細胞色素C氧化酶1、細胞色素C氧化酶2和超氧化物歧化酶在脂肪細胞特異性ATF3轉基因小鼠的白色脂肪組織中與野生型(WT)小鼠相比下調。最近Cheng等[23]研究表明，與喂食高脂野生組(HFD-WT)小鼠相比，ATF3 基因敲除小鼠表現出代謝失調，包括肥胖和胰島素抵抗；在體外，ATF3的過度表達誘導白色脂肪細胞轉分化為米色/棕色脂肪細胞；他們進一步研究發現，ST32da，一種從ATF3特異性啟動子篩選平臺中選擇的合成ATF3誘導劑，通過抑制碳水化合物反應元件結合蛋白-硬脂酰輔酶a去飽和酶-1軸(ChREBP-SCD-1)增強ATF3表達以下調脂肪因子基因并誘導脂肪細胞褐變；而ATF3誘導劑ST32da調控棕色和米色脂肪細胞代謝的信號通路和機制有待進一步研究。Kim等[24]研究表明，用查爾酮(包括2,2,4-三羥基查爾酮和丁烯)治療可導致ATF3的強烈誘導和C3H10T1/2細胞分化的抑制。綜上所述，這些發現表明ATF3在調節脂肪細胞生成、脂肪形成、成脂分化三方面起著有益的作用。

肝臟脂肪變性是由于甘油三酯合成、分解和分泌失調所致。ATF3基因缺陷小鼠出現肝臟脂肪變性，并在肝臟和多個免疫器官顯示髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)的擴張。經糖皮質激素(GC)處理或ATF3缺陷的G-MDSCs可促進肝臟脂質堆積，而耗盡G-MDSCs可減輕這些影響。進一步研究[25]表明，在MDSCs中，ATF3通過直接與負GR反應元件結合而被GC受體GR反式轉錄，而S100A9是G-MDSCs中ATF3的主要轉錄靶點，沉默S100A9可明顯減輕ATF3缺乏或GC處理引起的G-MDSCs增殖和肝脂肪變性。

2.3 ATF3調節肝臟免疫功能 目前ATF3在先天免疫和炎癥性疾病中的作用已經得到了很好的研究。在先天免疫中，ATF3通過與NF-κB相互作用和抑制促炎細胞因子如IL-6、IL-12b和Toll樣受體4 (TLR-4)在脂多糖處理的小鼠中起免疫調節劑的作用，但在內皮細胞中，ATF3主要在對TLR活化的反應中表達并促進炎癥[2]。de Nardo等[26]發現，高密度脂蛋白對TLR介導的炎癥的保護作用依賴于ATF3。在高密度脂蛋白存在的情況下，ATF3與IL-6、IL-12p40和TNF的啟動子結合。在應激誘導的免疫細胞激活后，ATF3被上調，隨后通過與其啟動子結合下調靶基因的表達，包括細胞因子(如IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12p40、IL-12b、IL-13、TNF和IFNβ/γ)和促凋亡基因(如Bak和Bax)。此外，ATF3通過TIAM2的表達增強中性粒細胞的趨化性。這些觀察表明，ATF3在調節免疫反應和維持正常宿主防御中起著至關重要的作用。

ATF3在自然殺傷細胞(NK細胞)內起調節抗病毒反應的作用。ATF3是巨噬細胞促炎細胞因子表達的負性調節因子，ATF3缺陷小鼠更容易內毒素休克。有研究[27]證明了ATF3與NK細胞中IFNγ基因的順式調控元件相互作用，并且ATF3缺失的NK細胞顯示出IFNγ的轉錄和分泌增加；NK細胞來源的IFNγ對小鼠巨細胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染具有保護作用，ATF3基因缺失的小鼠在受到MCMV攻擊時表現出肝病毒載量減少和肝組織病理學改變；用ATF3缺失NK細胞重組NK缺陷小鼠比用WT細胞重組小鼠更有效地控制了MCMV感染，表明ATF3在NK細胞內發揮調節抗病毒效應的作用。此外，在活性氧脅迫下，小鼠ATF3的喪失可防止細菌和真菌感染，活性氧增加ATF3的表達并抑制IL-6的產生，ATF3基因敲除小鼠易受感染[28]。

Zhu等[29]研究了肝臟缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusioninjury,IRI)模型中ATF3/mTOR/HIF-1軸調節免疫反應的機制。ATF3的缺失加劇了肝損傷，這可以通過血清ALT水平的升高、肝內巨噬細胞/中性粒細胞的轉運、肝細胞凋亡和促炎介質的上調來證明。ATF3缺乏促進mTOR和p70S6K磷酸化，激活高遷移率族蛋白1和TLR4，抑制脯氨酰羥化酶1，增加缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)活性，導致IRI肝臟Foxp3下調和RORγt、IL-17A上調。在體外，阻斷ATF3基因敲除(KO)小鼠的mTOR或p70S6K或骨髓來源的巨噬細胞可下調高遷移率族蛋白1、TLR4和HIF-1α，上調脯氨酰羥化酶1，增加Foxp3和降低IL-17A水平。HIF-1α在ATF3 KO小鼠中的沉默改善了IRI誘導的肝損傷，同時下調了IL-17A在ATF3缺陷小鼠中的表達。這些發現表明ATF3缺乏激活mTOR/p70S6K/HIF-1α信號，這對于調節TLR4驅動的炎癥反應和T淋巴細胞發育至關重要，為肝移植后肝IRI的治療提供了潛在的治療靶點。這些結果強調了ATF3介導的mTOR/p70S6K/HIF-1α信號在肝臟炎癥損傷過程中調節先天免疫和獲得性免疫中的作用。

3 ATF3與肝臟疾病的相關性

3.1 ATF3與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) Kim等[30]采用Zucker糖尿病肥胖大鼠針對ATF3的體內-jetPEI siRNA遞送系統用于功能喪失實驗，發現ATF3在Zucker糖尿病肥胖大鼠的肝臟和患有NAFLD或2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)的人群中高度表達，首次證明了ATF3有作為誘導肝脂肪變性和T2D有效調節因子的新功能。該實驗結果表明，胰島素抵抗和肝脂肪變性與ATF3表達增加及通過線粒體功能障礙減少脂肪酸氧化有關，而線粒體功能障礙通過體內ATF3沉默而減弱，這表明ATF3可能是預測NAFLD進展和T2D發展的生物標志物。

Fang等[31]使用小鼠的功能獲得和喪失方法發現,ATF3被干擾素調節因子-2結合蛋白2(interferon regulatory factor binding proteins,IRF2BP2)轉錄抑制調節NAFLD。他們確定IRF2BP2部分通過ATF3發揮作用，是抑制肝脂肪變性、胰島素抵抗和炎癥的整合轉錄抑制因子，并在控制NAFLD中充當內在抑制因子。將IRF2BP2作為治療靶點，利用其內在的限制性機制，可以為NAFLD的預防和治療開辟一條新的途徑。

Tu等[32]通過轉錄組學分析確定ATF3是脂肪心磷脂合成酶1(adipose cardiolipin synthase 1, CRLS1)基因敲除小鼠差異表達的關鍵基因，進一步研究發現，CRLS1在棕櫚酸刺激的肝細胞中抑制ATF3的表達及其活性，而ATF3則部分逆轉了代謝應激下CRLS1過表達所抑制的脂質堆積和炎癥。這些發現揭示了CCRLS1通過抑制ATF3的表達和活性，減輕非酒精性脂肪性肝炎病理過程中的胰島素抵抗、肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，對開發更具體的NAFLD治療策略具有重要的臨床意義。

3.2 ATF3與肝纖維化 以往研究表明ATF3在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型和膽管結扎的肝纖維化患者的肝組織樣本中上調，ATF3在活化的肝星狀細胞(HSC)和損傷的肝細胞中過度表達。

為了探討ATF3在肝纖維化中的作用，Shi等[33]首次提供了ATF3過度表達導致肝纖維化的證據，報告了ATF3在小鼠和人類纖維化肝臟、激活的HSC和損傷的肝細胞中過度表達。他們在體內和體外的研究表明，ATF3通過促進纖維化前基因的表達和HSC的激活而不是調節肝細胞的凋亡及增殖來加重肝纖維化；此外，ATF3核定位的增加促進了纖維化基因和在肝纖維化過程中過表達且具有人鼠同源性的長鏈非編碼RNA(lnc-SCARNA10)的轉錄，lnc-SCARNA 10通過募集SMAD3到這些基因的啟動子，在肝纖維化中作為TGFβ信號傳導的新的正調節因子發揮作用；進一步實驗發現lnc-SCARNA10以TGFβ/SMAD3依賴的方式促進ATF3的表達，揭示了TGFβ/ATF3/lnc-SCARNA10軸通過激活HSC促進肝纖維化。綜上所述，TGFβ/ATF3/lnc-SCARNA10軸通過激活HSC促進肝纖維化，這拓寬了ATF3的調節網絡，加深了對肝纖維化分子機制的理解，說明ATF3在激活HSC中的調節可能代表了抗肝纖維化的新治療方法,ATF3可能是開發肝纖維化治療策略的有用靶點。

3.3 ATF3與肝細胞癌 有研究[34-35]發現，ATF3在人肝細胞癌組織中的表達水平較低，有包膜侵襲的肝癌組織中ATF3的蛋白表達水平低于無包膜侵襲的肝癌組織。因此，基于ATF3的低表達，推測其在人肝細胞癌變過程中可能具有腫瘤抑制作用。Li等[36]已經表明ATF3的過表達抑制癌細胞生長，降低細胞周期進程，并增加HepG2細胞的凋亡活性。Wang等[35]通過細胞MTT實驗顯示，ATF3過表達的HepG2細胞增殖受到抑制，ATF3的低表達可能通過抑制細胞周期蛋白D1在肝癌中發揮抑癌作用。Chen等[37]發現ATF3在體內外均能明顯抑制肝癌細胞的增殖和遷移；富含半胱氨酸的血管生成誘導物61(cysteine-rich angiogenic inducer 61，CYR61)是ATF3轉錄調控的關鍵靶點；ATF3和CYR61在人肝癌組織中持續下調，其表達水平呈顯著正相關，ATF3通過靶向和調節CYR61在HCC中發揮腫瘤抑制作用。據報道[38]，ATF3參與睪丸孤核受4(testicular orphan receptor 4,TR4)上調肝癌細胞順鉑化療敏感性，TR4可能通過在轉錄水平改變ATF3的表達來增強順鉑的化療敏感性，并通過ATF3-siRNA阻斷ATF3的表達來逆轉TR4增強的順鉑化療敏感性。而通過改變TR4-ATF3信號來提高順鉑的療效也為更好地抑制肝癌進展提供了一種新的潛在的治療途徑。Weng等[39]發現，ATF3在氯硝柳胺誘導肝癌細胞內質網應激激活和誘導細胞凋亡中起著不可或缺的作用，氯硝柳胺上調肝癌細胞中ATF3、ATF4、CCAAT增強子結合蛋白和蛋白激酶R樣內質網激酶抗原的表達，可明顯誘導肝癌細胞凋亡；進一步研究發現經氯硝柳胺處理后，ATF3基因敲除的肝癌細胞比對照細胞具有更高的細胞活力。

然而，ATF3的過度表達增加了Hepa 1-6小鼠肝癌細胞的DNA合成和細胞周期蛋白D1的表達從而刺激肝細胞的增殖[14]。另外，Lin等[40]發現，當細胞骨架蛋白和SMAD3不起作用時，CREB-2和ATF3在肝癌形成中作為信號轉導的STAT3具有致癌作用。這些實驗研究結果表明，ATF3在肝癌中作為阻遏或激活因子起著抑制或促進成瘤的雙重作用，針對ATF3表達的干預可能代表了一種預防和治療肝癌的新方法。

4 總結與展望

ATF3作為細胞應激反應的關鍵調節劑，已被證明通過激活信號或調節靶基因的表達參與肝臟多種生理和病理過程。ATF3在肝臟中通過抑制糖異生、協調脂肪生成、激活免疫反應來調節肝臟代謝功能；而通過調節細胞周期進程對肝臟腫瘤起雙重調控作用。目前ATF3調控肝臟疾病的作用機制研究主要集中在NAFLD、肝癌中，ATF3在肝纖維化中被誘導的機制未被廣泛探索，ATF3的功能和對肝臟其他慢性疾病的調控作用也還未明確。 因此,深入探討 ATF3調控肝臟疾病發生、發展的分子機制對肝臟疾病的預防和治療至關重要，靶向ATF3可能為治療肝臟疾病發掘新的潛在靶點。未來的研究可集中在ATF3的蛋白質-蛋白質相互作用上，以期為肝病的預防和治療提供新的策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：辜群利負責課題設計，資料分析，撰寫論文；李暉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿參；鄧秀秀、曾子健、董海艦負責收集數據，修改論文。