微小RNA在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用

陳 圣， 陳國想， 何中明， 程樹杰， 趙繼森

1 河北大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科， 河北 保定 071000； 2 西南醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 四川瀘州 646000

膽管癌是指來源于膽管黏膜上皮的一類惡性腫瘤，是最常見的原發(fā)性膽道惡性腫瘤。根據(jù)膽管癌出現(xiàn)的不同解剖位置分為肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌及遠端膽管癌，后兩者以前通常稱為肝外膽管癌[1]。在過去的幾十年中，全球范圍內(nèi)膽管癌的發(fā)病率逐漸增加，約占消化道腫瘤的3%[2]。原發(fā)性硬化性膽管炎、肝硬化及肝吸蟲感染、膽管結(jié)石和Lynch綜合征是已知的膽管癌的危險因素[3]。由于缺乏典型的早期臨床癥狀和敏感的診斷指標(biāo)，大部分膽管癌患者通常在治療方式選擇受限制的晚期被確診。目前外科根治性切除手術(shù)仍是膽管癌患者治療的最佳選擇，但超過65%的患者因腫瘤大小、轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)浸潤等原因無法行手術(shù)治療。雖然輔助性放療、化療及靶向治療等治療方式對膽管癌有一定作用，但患者的整體預(yù)后仍不容樂觀，肝內(nèi)膽管癌的5年生存率僅2%～15%，肝外膽管癌為2%～30%[4]。因此，闡明膽管癌的分子發(fā)病機制對于提高膽管癌的早期診斷及改善預(yù)后可能至關(guān)重要。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明微小RNA(microRNA，miRNA)在膽管癌發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程中扮演著重要的角色。因此，本文將miRNA在膽管癌中的研究進展進行總結(jié)，對其與膽管癌的惡性生物學(xué)行為的影響進行探討，以期從miRNA的角度為了解膽管癌提供新的視角。

1 miRNA 簡介

成熟的miRNA是一類小的、高度保守的、內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長度為20～22個核苷酸序列[5]。它們在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性或影響翻譯從而對后生動物靶基因表達發(fā)揮負調(diào)控作用。單個miRNA可以調(diào)節(jié)200多個mRNA[6]。1993年Victor Ambros及其團隊提出第一個miRNA，描述了miRNA lin-4作用于靶基因lin-4 mRNA進而調(diào)控秀麗隱桿線蟲的胚胎后發(fā)育[7]。隨后，miRNA逐漸成為人們關(guān)注的熱點，越來越多的研究證實其在脊椎動物和人類的生理病理過程中發(fā)揮作用。目前為止，大約700種miRNA在機體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，可作為多種生物學(xué)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。

2 miRNA 在膽管癌中的發(fā)生發(fā)展的作用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步和miRNA調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展機制研究的不斷深入，其異常表達與膽管癌的關(guān)系漸漸被發(fā)現(xiàn)。目前，在膽管癌組織與正常膽管組織中發(fā)現(xiàn)了許多差異表達的miRNA，部分差異表達的miRNA被視為是膽管癌發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)控因子。Meng等[8]第一次通過微陣列技術(shù)分析正常膽管細胞與惡性膽管細胞之間存在多種表達持續(xù)改變的miRNA。部分miRNA表達的改變可以反映腫瘤細胞遺傳學(xué)異常，影響腫瘤的細胞周期、增殖、凋亡、炎癥及腫瘤微環(huán)境。

2.1 miRNA參與細胞周期、增殖及凋亡 細胞凋亡信號下調(diào)、細胞周期發(fā)生紊亂、細胞增殖失控是腫瘤發(fā)生的重要機制，很多miRNA與這些異常存在密切聯(lián)系。具有抑癌或促癌特性的多種miRNA在細胞中協(xié)同發(fā)揮作用以促進細胞表型的改變。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)在膽管癌組織和細胞中miR-30a-5p表達均顯著增高，其表達水平影響膽管癌細胞增殖及凋亡，證實細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)是miR-30a-5p的靶基因。SOCS3是JAK/STAT信號通路的活化劑的負反饋調(diào)節(jié)因子。miR-30a-5p通過抑制SOCS3表達，負調(diào)控SOCS3信號傳導(dǎo)促進膽管癌細胞的增殖。有研究[10]表明，miR-885-5p的過表達通過直接抑制GALNT3表達和間接下調(diào)IGF2BP1表達來抑制膽管癌細胞轉(zhuǎn)移及增殖，同時miR-885-5p通過抑制GALNT3進而調(diào)控PI3K/AKT/MMPs通路來抑制膽管癌轉(zhuǎn)移。Bcl-2是一種重要的癌基因，通過抑制促凋亡蛋白的激活來抑制凋亡，對膽管癌的發(fā)生有重要影響[11]。Yu等[12]通過對膽管癌組織與正常膽管組織對比分析發(fā)現(xiàn)，miR-612在膽管癌組織中的表達降低，在膽管癌細胞中沉默miR-612的表達可以上調(diào)靶基因Bcl-2表達，促進膽管癌細胞的增殖與侵襲。上述研究表明部分失調(diào)的miRNA參與調(diào)節(jié)膽管癌細胞的增殖、凋亡過程，這些miRNA可能是膽管癌潛在的治療靶點。

細胞周期紊亂是腫瘤細胞的基本特性之一。miRNA可以調(diào)節(jié)多種細胞周期相關(guān)因子的表達，其表達水平的改變可能直接、間接導(dǎo)致細胞周期發(fā)生紊亂。Chang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-551b-3p在膽管癌中低表達，miR-551b-3p通過下調(diào)CCND1(一種G1-S周期調(diào)控基因)誘導(dǎo)G1期細胞周期停滯和細胞凋亡來抑制膽管癌的進展。研究表明，miR-494在膽管癌中呈低表達狀態(tài)，可以誘導(dǎo)許多涉及細胞周期進展的基因失調(diào)，是膽管癌細胞生長的負調(diào)節(jié)分子。如miR-494過表達可以通過下調(diào)WDHD1的表達，抑制膽管癌細胞活力、阻止細胞周期進程，促進體內(nèi)膽管癌細胞凋亡[14]。miR-494也可以通過抑制CDK6、CDK4等多個細胞周期相關(guān)靶基因的表達，導(dǎo)致膽管癌細胞在G1/S周期停滯[15]。還有研究[16]表明，miR-494可以調(diào)控6個G2/M過渡基因，誘導(dǎo)G2/M細胞周期阻滯。這些研究表明miRNA在膽管癌細胞周期中起著重要的調(diào)節(jié)作用，為膽管癌發(fā)病機理研究提供了新的視角，可能成為膽管癌治療的候選靶標(biāo)。

2.2 miRNA參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移 局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。侵襲是指腫瘤細胞沿組織間隙侵犯和浸潤周圍組織進入循環(huán)系統(tǒng)的過程，轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞侵襲后在其他組織器官形成繼發(fā)性癌癥的過程。兩者是腫瘤進展過程中的不同階段。許多研究表明miRNA的表達失調(diào)與膽管癌的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)，如miR-137[17]、miR-21[18]、miR-24[19]、miR-34a[20]。在肝內(nèi)膽管細胞癌，miRNA-129-2-3p表達明顯降低，通過其靶基因Wip1抑制肝內(nèi)膽管細胞癌的增殖和侵襲[21]。在肝外膽管細胞癌中，miR-451a和miR-144-3p顯著低表達，可通過抑制膽管惡性腫瘤發(fā)生過程中的ATF2來減弱細胞遷移[22]。

2.3 miRNA參與膽管癌發(fā)展中的上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)過程 EMT是調(diào)節(jié)細胞從上皮向間充質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)化的過程。EMT被認為是癌癥進展和轉(zhuǎn)移中的前期與核心步驟。目前研究[18，23-24]表明，miRNA可以通過調(diào)控EMT過程參與膽管癌的發(fā)生。在這個過程中，miRNA影響N-鈣黏蛋白、波形蛋白以及E-鈣黏蛋白等EMT標(biāo)志物的表達水平。如Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)在膽管癌細胞系中過表達的miR-186可以使E-鈣黏蛋白表達顯著增加，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達減少。通過熒光素酶測定證實Twist1 (一種EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子) 是miR-186的直接靶基因。miR-186通過靶向Twist1抑制膽管癌細胞增殖、遷移、侵襲和EMT過程。實驗[26]表明，miRNA-329也可以抑制EMT過程，當(dāng)過表達miRNA-329時，波形蛋白和N-鈣黏蛋白減少而E-鈣黏蛋白表達增強。miR-424-5p參與肝內(nèi)膽管細胞癌的EMT過程，過表達的miR-424-5p可以上調(diào)E-鈣黏蛋白并下調(diào)N-鈣黏蛋白和β-鈣黏蛋白。進一步研究[27]發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p通過與靶基因ARK5 mRNA的3′-UTR結(jié)合，抑制mTOR磷酸化，從而抑制肝內(nèi)膽管細胞癌的EMT過程。ARK5是人類AMP激活的蛋白激酶(AMPK)家庭的新成員，研究[28-29]發(fā)現(xiàn)，ARK5的表達在多種癌癥的轉(zhuǎn)移和侵襲中起著重要作用。miR-494過表達可增加E-鈣黏蛋白的表達，而N-鈣黏蛋白、波形蛋白、Twist和MMP-9的表達則降低[30]。在測定了20例膽管癌患者的腫瘤組織和鄰近非腫瘤組織中上皮-間充質(zhì)標(biāo)記物的表達水平后，Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白和miR-200b低表達，間充質(zhì)標(biāo)記物纖維黏連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)高表達，轉(zhuǎn)錄因子AP-2α和絲裂原活化蛋白激酶7(mitogen-activated protein kinase 7，MAPK7)被鑒定為miR-200b的靶基因，隨后在小鼠模型中miR-200b的過表達可以抑制腫瘤形成和EMT減少。這些研究表明，在膽管癌發(fā)展中miRNA間接或者直接調(diào)控EMT可能是常見且至關(guān)重要的現(xiàn)象。EMT是膽管癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的主要機制之一。miRNA廣泛參與EMT的過程，可通過改變癌組織中miRNA的表達，逆轉(zhuǎn)EMT過程，抑制膽管癌轉(zhuǎn)移，改善膽管癌患者預(yù)后。但是，目前miRNA調(diào)控EMT的確切機制尚需進一步研究。

2.4 miRNA調(diào)節(jié)膽管癌中炎癥反應(yīng) 炎癥反應(yīng)是免疫反應(yīng)的一部分，可消除引起機體細胞損傷的病原微生物并促進組織修復(fù)[32]。然而，長期反復(fù)的慢性炎癥刺激會增加組織癌變的風(fēng)險。膽管細胞的惡性轉(zhuǎn)化被認為與膽道上皮的慢性炎癥有關(guān)[33]。損傷的膽管中存在高水平的促炎細胞因子是導(dǎo)致膽管癌進展的原因之一[34]。膽道炎性微環(huán)境中IL-6的濃度升高可能刺激多種致癌信號通路，如ERK、JAK-STAT和PI3K通路[35]。研究[36]發(fā)現(xiàn)，對于膽管癌患者來說，其膽道微環(huán)境及體循環(huán)中IL-6表達水平均增加，并在腫瘤生長中起重要作用。

研究證實，不管是自分泌還是外源性IL-6刺激均能改變機體內(nèi)miRNA的表達情況。Meng等[37]發(fā)現(xiàn)miRNA let-7的上調(diào)有助于膽管惡性腫瘤細胞中依賴IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT3的激活。這是首次發(fā)現(xiàn)miRNA在慢性炎癥和膽道惡性腫瘤中發(fā)揮作用。Lin等[38]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)膽管癌患者let-7c、miR-99a和miR-125b均被下調(diào)，進一步實驗發(fā)現(xiàn)，let-7c/miR-99a/miR-125b的過表達通過靶向IL-6/STAT3炎癥通路的重要細胞因子，進而抑制膽管癌細胞的遷移和侵襲。此外Meng等[39]發(fā)現(xiàn)IL-6通過miR-370的表達來促進膽管癌的生長。An等[40]隨后證實了這一結(jié)果。Ishigami等[41]通過體外實驗證實，外源性IL-6可以以劑量依賴性方式顯著上調(diào)膽管癌細胞系中miRNA-31表達和促進癌細胞的增殖，進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-31表達受IL-6/STAT3信號通路調(diào)節(jié)。這些研究強化了炎癥微環(huán)境、表觀遺傳學(xué)與膽管癌發(fā)生的分子機制之間相互作用的生物學(xué)基礎(chǔ)，同時也為靶向控制炎癥反應(yīng)的miRNA提供了理論基礎(chǔ)。

2.5 miRNA調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境 膽管癌典型的組織學(xué)特征是纖維增生，即大量的反應(yīng)性纖維化間質(zhì)包圍并浸潤腫瘤組織，由此形成復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境[42]。腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAF)是實體瘤腫瘤微環(huán)境中較豐富的細胞之一，也是膽管癌中促進腫瘤纖維形成和最有可能導(dǎo)致腫瘤進展的主要細胞[43]。NcRNAs也可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中除腫瘤細胞外其他細胞中基因的表達[44]。研究發(fā)現(xiàn)，在由膽管癌組織分離的CAF中miR-15a和miR-148a的表達較正常皮膚成纖維細胞顯著下調(diào)。此外，miR-15a抑制纖溶酶原激活物抑制物-2的表達，促進膽管癌細胞的遷移[45]。在多種癌癥相關(guān)的纖維細胞中miRNA-148a存在下調(diào)，CAF中過表達的miR-148a 通過直接靶向Wnt10B(wnt蛋白家族成員之一)影響腫瘤的生物學(xué)表型[46-47]。這些研究表明miRNA在促進CAF形成、影響腫瘤微環(huán)境、進而參與調(diào)節(jié)膽管癌進展中具有重要意義。通過阻斷這些miRNA相關(guān)炎性信號傳導(dǎo)可能為膽管癌的治療提供策略。

2.6 miRNA參與膽管癌吉西他濱耐藥 吉西他濱是一種脫氧胞苷類似物，通過阻斷DNA雙鏈延長從而中止細胞周期進程[48]。吉西他濱是膽管癌一線化療藥物之一，但多數(shù)患者服藥后經(jīng)常觀察到吉西他濱的內(nèi)在或獲得性耐藥[49]。有證據(jù)[27]表明，吉西他濱耐藥機制包括Wnt/β-Catenin、NF-кB、AKT和MAPK等通路。多種miRNA參與調(diào)節(jié)膽管癌對吉西他濱的敏感性和耐藥。Meng等[50]研究發(fā)現(xiàn)miR-21通過靶向PTEN抑制吉西他濱的細胞毒性，導(dǎo)致其對AKT / mTOR信號傳導(dǎo)的抑制作用減弱。Carotenuto等[51]研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-1249表達的膽管癌細胞系在化療后損害了CD133+細胞的擴增及其富集，降低了癌癥干細胞標(biāo)志物的表達，并增加了吉西他濱的化學(xué)敏感性，其主要通過靶向卷曲蛋白8/Wnt信號傳導(dǎo)來介導(dǎo)具有化學(xué)抗性的CD133+膽管癌細胞的擴增。研究發(fā)現(xiàn)，miR-210過表達通過靶向缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子-1α(HIF-1α)的負調(diào)節(jié)劑HIF-3α，降低了膽管癌細胞對吉西他濱的敏感性，miR-210 /HIF-1α的通過調(diào)節(jié)HIF-3α，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境缺氧，引起膽管癌細胞的細胞周期停滯和吉西他濱耐藥[52]。miR-130a-3p在吉西他濱耐藥的膽管癌細胞中的表達水平上調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn),在膽管癌細胞中過表達的miR-130a-3p通過抑制過氧化物酶體增殖劑激活受體γ增加吉西他濱的耐藥性[53]。上述研究表明，miRNA與膽管癌出現(xiàn)吉西他濱耐藥存在相關(guān)，通過調(diào)節(jié)這些miRNA表達可能有助于改善膽管癌吉西他濱耐藥，以延長膽管癌患者生存時間。

3 外泌體miRNA與膽管癌

許多研究已經(jīng)證實了腫瘤來源的外泌體在促進癌細胞增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移方面的功能[54]。外泌體是存在于體液中的miRNA的有效且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)運載體，有證據(jù)[55]表明，與正常人群相比，膽管癌患者外泌體miRNA的表達也發(fā)生了改變。Kitdumrongthum等[56]發(fā)現(xiàn)與正常膽管細胞的外泌體miRNA相比，膽管癌細胞外泌體中存在498個顯著差異的miRNA，其中miR-205-5p顯著上調(diào)，敲低miR-205-5p表達可抑制膽管癌細胞系中的遷移和侵襲。Xue等[57]通過分析膽管癌患者血液來源的外泌體同樣發(fā)現(xiàn)四種miRNA(miR-96-5p、miR-151a-5p、miR-191-5p和miR-4732-3p)顯著上調(diào)。研究[58]發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者血清外泌體miR-200c-3p顯著上調(diào)，miR-200c-3p表達水平越高，膽管癌進展速度越快。上述研究表明，在膽管癌中存在部分異常表達的外泌體miRNA。雖然對這部分異常表達的外泌體miRNA的生物學(xué)功能和分子作用機制的了解有限，但將來其有望成為新的膽管癌治療靶點及潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)記物。

4 小結(jié)與展望

越來越多的研究證明了miRNA參與了膽管癌的發(fā)生和發(fā)展，miRNA在調(diào)控基因表達、影響膽管癌的發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要作用，對于這些miRNA的深入研究不僅可以揭示膽管癌的病理生理分子機制，還可以為診斷及治療膽管癌提供新思路。表達失調(diào)的miRNA在膽管癌外泌體和體液外泌體中完整存在且兩者表達具有相關(guān)性，使其在未來成為膽管癌診斷標(biāo)記物成為可能。盡管miRNA成為膽管癌診斷標(biāo)記物具有良好前景，但到目前為止，眾多miRNA參與膽管癌的調(diào)控仍缺乏共性及準(zhǔn)確性，并且miRNA在膽管癌的作用仍主要存在于體外細胞實驗階段，需要在未來進行體內(nèi)研究，以期形成基于miRNA的膽管癌的治療策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：陳圣負責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；陳國想、何中明參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；程樹杰、趙繼森負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。