非小細胞肺癌新靶向癌基因的研究進展

耿僡臨，胡鵬程，翁 艷

目前，肺癌是癌癥死亡的主要原因之一，非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌的85%，治療以手術切除為主，且多數患者在確診時已為晚期，預后不良。近年NSCLC的治療方法已取得較大進展，尤其是針對特異性分子改變的靶向治療。識別腫瘤的基因突變可有效促進靶向治療的發展。全基因組篩查肺癌的基因突變為患者提供新的治療機會，不同分子分型的患者也已從靶向治療中獲益。最近的全基因組測序分析發現NSCLC中復雜的分子改變，并為個體化醫學的發展提供基礎，個體化用藥的成功依賴于適當選擇對治療有反應的患者，新一代測序技術可以對癌癥基因組進行更深入的研究。因此，NSCLC新分子靶點是目前研究的重點。本文對近年NSCLC靶向癌基因的研究進展作一綜述，包括ROS1、RET、HER-2、FGFR1、BRAF和DDR2基因，為NSCLC靶向治療提供更有效的依據。

1 ROS1基因重排

ROS1位于第6號染色體上，編碼1個受體酪氨酸激酶，由富含糖蛋白的胞外結構域、跨膜結構域及胞內酪氨酸激酶組成。ROS1重排最初在膠質母細胞瘤細胞系中被發現，產生新的融合基因，ROS1融合是潛在的致癌因素。最近，在其他幾種惡性腫瘤中也發現ROS1重排，包括膽管癌、卵巢癌和胃癌。ROS1重排的NSCLC是一種具有獨特臨床病理特征的分子亞型。研究表明，ROS1重排的NSCLC患者年齡較小，無吸煙史，腫瘤分期多為晚期，組織學類型多為腺癌，在大細胞癌和鱗狀細胞癌中較少出現[1-2]。

ROS1是NSCLC有效的治療靶點。在1%～2%的NSCLC中出現ROS1基因染色體重排。臨床攜帶ROS1融合基因的NSCLC患者對ROS1靶向酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKI)產生明顯的治療反應。間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因重排NSCLC也是一種獨特的分子亞型。ROS1重排患者與ALK陽性患者具有很多共同特征，ROS1基因與ALK基因具有同源性，這種結構相似性是利用ALK抑制劑治療ROS1陽性NSCLC的理論基礎。克唑替尼是目前治療ROS1陽性NSCLC的一線藥物，對克唑替尼耐藥性機制的研究也促進了新型酪氨酸激酶抑制劑的發展。目前另外幾種具有ROS1抑制活性的抑制劑，包括氯拉替尼、卡伯贊替尼、恩替尼等亦正在研究中[3-4]。

在NSCLC中，ROS1重排與其他致癌基因(包括EGFR、KRAS、ALK等)的改變同時發生較少，且這些基因改變通常相互排斥。但在一項對ROS1重排NSCLC的高通量測序研究中發現一些額外的基因改變，包括TP53突變、CDKN2A/B缺失和CTNNB1突變。臨床發現患者可能存在其他癌基因的伴隨突變，應在進行靶向治療之前確認分子診斷。對于ROS1重排和其他基因改變同時發生的頻率，以及與ROS1融合共同發生的基因變化是否與其生物學行為和治療相關，需收集更多的病例進行分析[5-7]。

目前，檢測ROS1的方法包括免疫組化、FISH、RT-PCR、DNA或RNA測序，每種檢測方法均有其獨特的優勢和挑戰。雖然使用ROS1免疫組化抗體D4D6可篩選適合靶向治療的NSCLC患者。有文獻報道免疫組化和FISH檢測結果不一致病例，免疫組化檢測ROS1呈強陽性，而FISH檢測呈陰性。ROS1重排NSCLC在年輕和晚期患者中發生率高，組織學表現為篩狀結構、細胞外黏液和砂粒體，而ROS1檢測不一致病例發生在分期較早的老年患者，組織學呈鱗屑樣生長方式。大多數ROS1重排NSCLC無其他基因的聯合突變，73%的ROS1檢測不一致病例同時存在其他基因突變，包括EGFR和ERBB2[8]。通過排除EGFR/ALK陽性病例，使用免疫組化法篩查ROS1陽性病例進行FISH檢測，可增強識別ROS1重排肺癌的可能性，并避免對所有病例進行昂貴且耗時的FISH檢測[9]，目前具體的實施還需制定標準化的評分標準進行評估。

2 RET基因重排

RET是一種在轉染過程中發生重排的原癌基因，位于染色體10q11.2，編碼1個受體酪氨酸激酶，由胞外結構域、跨膜結構域和胞內酪氨酸激酶3個結構域組成。RET通常在神經元、交感神經節和副交感神經節、甲狀腺C細胞、腎上腺髓質細胞、泌尿生殖道細胞和睪丸生殖細胞中表達。RET激活后發生自體磷酸化，并參與下游信號通路RAS/MAPK/ERK、PI3K/AKT和磷脂酶C-γ，促進細胞生長、遷移和分化，其功能改變與人類癌癥有關。最近，在NSCLC中也發現RET基因重排，已確定4種不同的RET融合基因：KIF5B、CCDC6、TRIM33和NCOA4，其中KIF5B最常見。除TRIM33外，其余基因均位于10號染色體上，因此NSCLC中RET融合主要是通過染色體內重排發生。NSCLC中RET重排檢測方法包括FISH、RT-PCR和免疫組化，其中FISH檢測最為準確。RET基因重排與EGFR、KRAS、ALK、HER-2和BRAF基因突變相互排斥，提示RET基因融合是NSCLC中獨立的致癌因素。有研究表明，RET基因融合是NSCLC可行的治療靶點。在表達KIF5B-RET的細胞系模型中，具有抗RET活性的多靶點TKIs(舒尼替尼、索拉非尼和萬德他尼)可抑制腫瘤細胞生長，相反，用不具有抗RET活性的吉非替尼或克唑替尼治療，則無抑制作用[10-11]。

3 HER-2基因擴增

HER-2(EGFR2/ERBB2)是EGFR受體酪氨酸激酶家族的成員之一，HER-2基因位于17號染色體上，編碼1個具有內在酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，與EGFR受體具有同源性，在某些人類腫瘤的發病機制中起重要作用。所有HER-2基因突變均為第20外顯子的框架內插入，與EGFR基因插入相同。HER-2基因擴增導致蛋白表達增強。近年已有研究報道其在肺癌中發生突變。HER-2在乳腺癌和卵巢癌中均存在過表達和基因擴增，與患者預后不良相關。肺癌中HER-2基因擴增的發生率低于乳腺癌，HER-2過表達約占20%，主要為不吸煙的腺癌患者。曲妥珠單抗是一種人源性單克隆抗體，結合HER-2的細胞外區域，與其他細胞毒藥物一起使用對治療HER-2過表達乳腺癌患者有效，然而在NSCLC中，使用曲妥珠單抗的臨床試驗結果并不理想。蛋白激酶抑制劑吉非替尼(易瑞沙，ZD1839)和厄洛替尼(特羅凱，OSI-774)目前也用于治療NSCLC。

EGFR家族成員還包括EGFR(HER-1/ERBB1)、EGFR3(HER-3/ERBB3)和EGFR4(HER-4/ERBB4)，這些基因均包含細胞外、跨膜和細胞內區域，最大的同源區域是包含在細胞內的激酶區域。這些基因均有不同的特性，HER-2有很強的激酶活性，能形成同源二聚體和異源二聚體，但無確定的配體；EGFR3在關鍵的TK結構域殘基上發生替換而缺乏激酶活性。最近，關于EGFR TK結構域突變的研究發現，其可預測吉非替尼或厄洛替尼的敏感性，這些研究結果引出“致癌基因成癮”的概念，即假設癌細胞均是依賴于活化的致癌基因而存活。因此，包括EGFR家族成員在內的蛋白激酶的致癌活化均應是癌癥治療的靶點[12-13]。

NSCLC細胞系和20%～50%的病理標本均表達HER-2，表明HER-2是NSCLC有意義的研究靶點。HER-2表達是影響患者預后的獨立因素。在乳腺癌中使用FISH檢測HER-2基因擴增情況，選擇符合曲妥珠單抗治療條件的患者。在對肺癌細胞系的研究中發現，HER-2蛋白表達與單獨使用曲妥珠單抗或聯合使用細胞抑制藥物的有效性存在正相關。在肺癌中，目前還不明確什么水平的HER-2蛋白表達或基因擴增程度將影響患者預后和治療，因此還需進一步開展前瞻性的臨床試驗。根據乳腺癌研究的臨床經驗，應重點關注HER-2免疫組化3+和(或)基因擴增的NSCLC患者。

4 FGFR1基因擴增

成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)家族由18個內在組織調節多肽組成，這些多肽通過結合、激活跨膜FGF受體(FGFR)酪氨酸激酶調控細胞生長。FGFR屬于糖基化多肽，由胞外結構域、跨膜結構域和胞內酪氨酸激酶結構域組成，有4個基因編碼FGFR：FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。FGF信號通路的異常表達、激活或失活與多種發育障礙疾病和腫瘤相關[14]。配體與FGFR結合，激活下游3個通路：Ras-MAP激酶通路、PI3K-AKT-mTOR通路和PLCγ-Ca2+通路，以控制細胞增殖和分化。FGFR底物FRS2的磷酸化水平升高與FGFR抑制劑的敏感性增加有關，表明FGFR信號活躍的細胞可能對治療更為敏感，然而FGF配體在腫瘤微環境中的分泌可能并不能激活人類腫瘤中的FGFR。因此，FGF配體的表達與FGFR抑制反應之間的相關性，還需在人類腫瘤及其微環境的肺癌模型中進一步分析。

FGFR1是一個膜結合受體酪氨酸激酶，通過MAPK和PI3K通路調節增殖，類似EGFR。

在20%的肺鱗狀細胞癌中存在FGFR1擴增，在肺腺癌中僅占1%。使用FGFR抑制劑的治療在臨床實驗中顯示出部分的治療反應。MYC是細胞增殖的調節因子，在腫瘤中過表達，也參與細胞凋亡。與單獨表達FGFR1的細胞相比，同時表達MYC和FGFR1的細胞系對FGFR抑制更敏感，提示共同表達MYC可能增加FGFR抑制劑的敏感性。另外，在肺癌的免疫治療中，FGFR抑制可能導致活化的T細胞抗原呈遞增加，表明免疫治療聯合FGFR抑制劑可能增強治療反應。因此，FGFR抑制劑可與其他靶向治療或免疫治療聯合使用。對FGFR1基因擴增腫瘤發病機制的探索，以及對FGFR抑制劑敏感性和介導耐藥的因素更深入的分析，對選擇患者和提高FGFR抑制劑在肺癌中治療的成功率至關重要[15-16]。

5 BRAF基因突變

BRAF是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通常被人類癌癥中的體細胞點突變激活。BRAF位于MAPK信號級聯系統中KRAS的下游。BRAF突變發生在60%的黑色素瘤中，并在其他惡性腫瘤(如結直腸癌、卵巢癌和甲狀腺乳頭狀癌)中高頻出現，表明RAS-RAF-MEK-ERK通路在促進腫瘤的發生中具有重要意義。RAF-MEK-ERK信號轉導通路是一種保守的由RAS激活的蛋白激酶級聯反應，通過對生長因子、細胞因子和激素的反應調節細胞生長、增殖和分化。RAF是RAS下游識別的第一個效應器。RAF激活由RAS-GTP與位于激酶N端調節區域內的RAS結合域(receptor-binding domain, RBD)結合啟動，隨后促進RAF磷酸化，刺激其絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，觸發MEK和ERK的連續磷酸化和激活。人類三種功能性RAF蛋白ARAF、BRAF和CRAF(CRAF-1)依賴于活化片段的磷酸化，BRAF的激酶活性最高。目前已發現30多個與人類癌癥相關的BRAF基因突變，其中大部分位于激酶結構域內。BRAF突變是惡性腫瘤的關鍵促進因子[17]。

在黑色素瘤中，BRAF突變最常見于15號外顯子，在密碼子600(V600E)處的纈氨酸取代谷氨酸[18]，而NSCLC中BRAF突變大多數都不是11號和15外顯子中的V600E。在NSCLC細胞系中，BRAF突變大多來自腺癌細胞系，有研究在肺腺癌中發現了11號外顯子上的2個新突變：V458L和K438T。V458L是甘氨酸環(G環)中第1個甘氨酸上游的5個密碼子，其可能會改變相鄰G環的結構，從而導致活化；K438T突變改變了AKT磷酸化的蘇氨酸旁殘基，BRAF有3個AKT磷酸化位點：Thr439、Ser428和Ser364，K438T和K438Q可能會抑制相鄰Thr439的AKT依賴性磷酸化。另外，有研究在肺鱗狀細胞癌中發現了位于11號外顯子的T439P突變和15號外顯子的L596V、V599E突變[19]。另一項研究中，127例肺腺癌中有2例BRAF突變，1例為11號外顯子中G1394T(G465V)錯義突變，1例為15號外顯子中T1787G(L596R)錯義突變[20]。這些研究表明，BRAF突變激活可能通過多種機制發生[21]。

目前，NSCLC中BRAF突變罕見，與黑色素瘤中的BRAF突變在性質上存在差異，并且BRAF突變對預測靶向藥物療效的價值仍不清楚，特別是對于BRAF非V600E的突變。因此，還需更深入、更大樣本量的臨床試驗[22-23]。

6 DDR2基因突變

盤狀蛋白結構域受體(discoidin domain receptors, DDR)是與EGFR同源的受體酪氨酸激酶，盤狀蛋白結構域受體DDR1和DDR2與多種人類癌癥有關，如乳腺癌、食管癌、卵巢癌和肺癌。DDR1基因由19個外顯子組成，編碼序列為2 742 bp；DDR2也有19個外顯子，編碼1個2 568 bp的mRNA。DDR1在腫瘤細胞中優先表達，而DDR2在腫瘤間質中表達，傳遞細胞外間質信號，在細胞增殖、黏附、遷移和腫瘤轉移中起調節作用。DDR2包括獨特的盤蛋白同源區、柄區、跨膜區、近膜區和激酶區。DDR2與內源性配體膠原蛋白結合，通過與配體結合和磷酸化激活時促進細胞遷移和生長增殖。在肺癌中已發現2個DDR2突變：R105S和N456S。在一項對290例肺鱗狀細胞癌樣本的研究中，發現11例DDR2基因新的體細胞突變，DDR2可能是肺鱗狀細胞癌的重要治療靶點之一[24-25]。

綜上所述，NSCLC新靶點的研究在指導臨床靶向治療中具有重要作用，包括ROS1和RET基因重排、HER-2和FGFR1基因擴增、BRAF和DDR2基因突變等，但這些研究尚未完善，還需更大樣本量實驗和臨床研究，為NSCLC的分子分型及臨床靶向治療提供更準確、更有效的依據。