干眼中結(jié)膜杯狀細胞及其分泌的黏蛋白的變化

王振宇

隨著社會的發(fā)展和視頻終端的使用，干眼越來越成為影響人們身心健康的眼科常見疾病之一。世界范圍內(nèi)，約有四分之一的眼科患者會主訴與干眼相關(guān)的各種眼部不適。根據(jù)2017年TFOS DEWS II的定義，干眼是一種多因素疾病，以持續(xù)的淚膜不穩(wěn)定為特征，引起眼部不適與視覺損傷，同時伴有不同程度的角膜上皮疾病及炎癥[1]。正常眼表淚膜可分為三層，即表面的脂質(zhì)層，中間的水液層和底面的黏蛋白層。結(jié)膜杯狀細胞及其分泌的黏蛋白，在維持淚膜穩(wěn)定及角膜上皮完整性上具有重要作用，成為干眼研究的一個重要領(lǐng)域。研究表明，年齡、眼表炎癥、淚液高滲透壓、局部藥物毒性等多種情況都可導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細胞的丟失或功能異常，以及黏蛋白分泌的減少，造成淚膜穩(wěn)定性下降和角膜上皮損傷，從而加重干眼的惡性循環(huán)。

一、結(jié)膜杯狀細胞的生理特性

正常結(jié)膜是一個富含杯狀細胞的粘膜組織，人類的杯狀細胞通常散在分布，但在鼻側(cè)有聚集[2]。淚液中的生長因子EFG及Th2細胞產(chǎn)生IL-13等因子具有促進杯狀細胞的增殖以及蛋白合成的作用，而膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)可以刺激杯狀細胞反射性地分泌黏蛋白[3，4]。結(jié)膜杯狀細胞表達黏蛋白基因MUC5AC、MUC5B和MUC2，其中人類淚液中主要為黏蛋白MUC5AC[5]。黏蛋白具有維持眼表水潤、淚液穩(wěn)定等作用，還能夠協(xié)助清除外界病原體和組織碎片[6，7]。角膜上皮會產(chǎn)生與細胞膜錨定的黏蛋白MUC1、MUC4和MUC16，目前還不清楚分泌的黏蛋白是否與角膜上皮錨定的黏蛋白產(chǎn)生相互粘附。

除了分泌黏蛋白，杯狀細胞還是結(jié)膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分。杯狀細胞能夠跨越2～3層上皮細胞的厚度，使它可以作為抗原傳遞者，將眼表的抗原傳遞給結(jié)膜基質(zhì)中的單核巨噬細胞[8]。杯狀細胞還能產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子，如TGF-β和維甲酸等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9]。同時杯狀細胞還是眼表固有免疫的主要成分，能夠產(chǎn)生可溶性黏蛋白、三葉肽因子、防衛(wèi)素和其他抗菌成分，阻止外界微生物的入侵[10，11]。呼吸道中的杯狀細胞能夠分泌細胞因子和白細胞介素，誘導(dǎo)Th2細胞反應(yīng)，結(jié)膜杯狀細胞是否有相同的功能還不清楚，但如果結(jié)膜杯狀細胞缺失或者黏蛋白分泌減少會加重眼表炎癥反應(yīng)[12]。

杯狀細胞與鄰近結(jié)膜上皮細胞間的緊密連接由成孔連接蛋白2和成孔連接蛋白10組成，從而形成能夠“滲漏”的結(jié)膜上皮，方便調(diào)節(jié)細胞旁轉(zhuǎn)運[13]。交感神經(jīng)能夠刺激結(jié)膜鱗狀上皮細胞復(fù)層，對于杯狀細胞的作用不明，而副交感神經(jīng)能夠刺激杯狀細胞分泌，對于旁邊的復(fù)層鱗狀上皮細胞沒有明顯影響。生長因子、乙酰膽堿、組胺和前列腺素能夠刺激杯狀細胞來源的黏蛋白，而對于結(jié)膜上皮細胞的作用不清楚[14，15]。因此，結(jié)膜中不同細胞的特異性分化及功能調(diào)節(jié)，仍然需要大量的研究工作來闡明。

之前的研究表明，結(jié)膜細胞譜系與角膜上皮譜系并不完全相同，結(jié)膜杯狀細胞是有增殖能力的慢循環(huán)細胞，在穹窿區(qū)杯狀細胞和角化細胞擁有共同的雙能祖細胞，這些提示杯狀細胞可能存在前體細胞或干細胞，這些具有干細胞特性的細胞群在眼表廣泛分布，但在內(nèi)眥部和下穹窿區(qū)更密集[16，17]。在角膜緣干細胞缺乏中，能夠觀察到含有不同數(shù)目的增殖細胞、慢循環(huán)角膜祖細胞和有絲分裂后杯狀細胞的復(fù)合體從角膜緣區(qū)域向角膜中央遷移，最終在眼表形成更多的杯狀細胞[18]。因此，為了更好研究及改善干眼的治療，有必要尋找可靠的杯狀細胞干細胞標記物，以及杯狀細胞分化的調(diào)控機制。

二、干眼對杯狀細胞的影響

干眼中眼表長期存在炎癥反應(yīng)，會導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量的減少，同時黏蛋白MUC5AC和其他杯狀細胞的產(chǎn)物也同等比例的減少[19]，且杯狀細胞的減少與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，杯狀細胞的丟失也與OSDI量表測量的眼表刺激癥狀呈正相關(guān)[24]。但到目前為止，干眼炎癥反應(yīng)導(dǎo)致杯狀細胞減少的確切機制還不完全清楚。在兔干眼模型中，去除干眼誘導(dǎo)因素，杯狀細胞的減少和其他干眼體征仍然持續(xù)了兩周[20]。TNF-α、IFN-γ等炎癥因子是導(dǎo)致杯狀細胞數(shù)量和分泌減少的關(guān)鍵因子[21]。相反，暴露于過敏環(huán)境中能夠刺激杯狀細胞的存活、增殖和分泌。組胺、白介素、前列腺素和其他過敏因子刺激了黏蛋白的分泌，但具體機制也不完全清楚[22]。通過轉(zhuǎn)錄因子SPDEF，自然殺傷T細胞來源的IL-13能夠上調(diào)杯狀細胞的數(shù)量，誘導(dǎo)杯狀細胞分化[23]。在部分干眼模型中發(fā)現(xiàn)，淚液的高滲透壓也造成了結(jié)膜杯狀細胞的丟失。這些研究表明，對于不同的外部環(huán)境和特定物質(zhì)的刺激，結(jié)膜杯狀細胞的反應(yīng)并不相同。

Th1細胞、NK細胞和單核-巨噬細胞來源的IFN-γ能夠引起杯狀細胞分泌功能障礙，誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)，進而導(dǎo)致杯狀細胞的凋亡[25，26]。在淚液缺乏性干眼，特別是Sj?gren綜合征中，可以發(fā)現(xiàn)結(jié)膜中IFN-γ以及其誘導(dǎo)的趨化因子CXCL-10的增加，同時淚液中IFN-γ等細胞因子的濃度也明顯升高[27，28]。研究還表明，在免疫缺陷小鼠中，轉(zhuǎn)移的CXCR3+CD4+ T細胞由于眼表干燥壓力產(chǎn)生的IFN-γ，引起杯狀細胞的廣泛死亡。APC細胞導(dǎo)致淚液中IL-12增加，刺激T細胞和單核-巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ介導(dǎo)趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11等，導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細胞丟失，從而形成一個自增強的炎癥循環(huán)。

臨床前期的研究表明，能夠抑制干眼、減少細胞因子和炎癥反應(yīng)的治療方法，也能夠增加結(jié)膜杯狀細胞的密度。FDA批準的CsA三期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，CsA治療水樣缺乏性干眼6個月后，結(jié)膜杯狀細胞的密度明顯增加，Sj?gren's綜合征患者中增加198%，非Sj?gren's綜合征患者中增加234%[29]。糖皮質(zhì)激素(氟米龍)和維生素A治療干眼的臨床研究中，也發(fā)現(xiàn)了結(jié)膜杯狀細胞密度的增加[30，31]。FDA最新批復(fù)的治療干眼新藥，LFA-1拮抗劑立菲斯特，在小鼠干眼模型中也發(fā)現(xiàn)能夠增加結(jié)膜杯狀細胞的密度，但在人類的臨床試驗中尚無類似的研究報道[32]。

年齡一直是干眼的危險因素之一，大的流行病學(xué)調(diào)查顯示，50歲之后，男性和女性干眼的發(fā)病率顯著提高，尤其以女性顯著[33，34]。相關(guān)的年齡改變包括淚河高度、淚液中炎癥因子增加、角膜神經(jīng)密度降低等，同時多個組織中炎癥標記物IL-6、TNF-α和IFN-γ等也隨著年齡增加，稱之為炎性老化[35，36]。這些炎癥介質(zhì)中，IFN-γ因為能夠促進角膜、結(jié)膜和淚腺的凋亡而顯得尤為重要。在老化的小鼠結(jié)膜中，發(fā)現(xiàn)了CD4+ T細胞的增加和杯狀細胞的減少，而在IFN-γ缺陷小鼠中，與年齡相關(guān)的杯狀細胞的丟失明顯減少了[37，38]。老化結(jié)膜中其他的危險因素還包括APC細胞的啟動、病理性Th1細胞等，這些都引起年齡相關(guān)的杯狀細胞的減少。

三、干眼中黏蛋白的改變

干眼中結(jié)膜杯狀細胞的丟失首先引起黏蛋白分泌的減少。干眼患者的淚液中，黏蛋白MUC5AC的濃度降低，但研究顯示干眼患者中MUC5AC基因的表達沒有變化或者上升了[39，40]，這種差異主要源于干眼的嚴重程度不同。基因表達的上調(diào)可能是對黏蛋白分泌下降的代償性調(diào)節(jié)，但也有研究注意到，干眼患者中MUC2基因表達下調(diào)了。在干眼病理過程中，也發(fā)生了黏蛋白糖基化的改變，在一部分沒有干眼體征但有干眼癥狀的患者中有黏蛋白MUC2和MUC5AC糖基化的改變，MUC2和MUC5AC在維持淚液流體力學(xué)特性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[41，42]。

在干眼患者中，還發(fā)現(xiàn)了膜相關(guān)黏蛋白基因MUC1、MUC4和MUC16表達的降低。這些黏蛋白是糖萼的主要成分，其表達的減少會導(dǎo)致眼表保護功能降低，眼表潤滑作用也會相應(yīng)降低[43，44]。MUC1糖基化的改變，在輕到中度患者中，主要表現(xiàn)為MUC1唾液酸化增加，而在重度患者中，主要表現(xiàn)為MUC1唾液酸化減少[45]。

研究發(fā)現(xiàn)，Sj?gren’s綜合征患者中，MUC5AC基因表達降低，同時淚液中MUC5AC的濃度也下降了，還有報道發(fā)現(xiàn)Sj?gren’s綜合征中的MUC19基因表達和終產(chǎn)物也下降了[46]。另一方面，Sj?gren’s綜合征患者中淚液中可溶性MUC16的濃度升高了，但結(jié)膜組織中膜結(jié)合MUC16沒有明顯變化[47]。而有研究顯示，無論淚液中可溶性MUC1還是結(jié)膜組織中膜結(jié)合MUC1，在Sj?gren’s綜合征患者中都增加了[48]。研究者認為無論黏蛋白MUC1還是MUC16的升高都是一個代償反應(yīng)，這樣可以維持干眼狀態(tài)下眼表的功能。

四、促進杯狀細胞恢復(fù)的方法

在結(jié)膜或杯狀細胞遭受損害后，自體健康結(jié)膜組織移植是恢復(fù)眼表和結(jié)膜功能的一個理想方法，但很多時候并不可行，于是研究者一直在尋找其他可替代的粘膜組織移植。口腔粘膜易于獲取，但其不含杯狀細胞，不利于淚膜恢復(fù)。羊膜組織具有很好的抗炎作用，而且有利于結(jié)膜上皮化，廣泛應(yīng)用于眼表重建。結(jié)膜細胞目前可以在體外支架材料上培養(yǎng)，這為嚴重的結(jié)膜損傷患者提供了移植材料。結(jié)膜下成纖維細胞和上皮細胞共培養(yǎng)，促進了結(jié)膜祖細胞的生長。在角膜緣干細胞缺乏時，往往也伴有杯狀細胞的大量丟失，此時自體或親屬的角膜緣組織移植可以提供大量的角膜緣干細胞。在炎癥誘導(dǎo)的干眼模型中，眶周注射間充質(zhì)干細胞后，眼表炎癥因子的表達和CD4+ T細胞的浸潤減少了，而淚液分泌和杯狀細胞的數(shù)量增加了[49]。

研究發(fā)現(xiàn)，溶解素能夠終止干眼中的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)杯狀細胞分泌黏蛋白，因此可能成為治療干眼的一個新的方向[50]。溶解素D1通過磷脂酶A2、C、D，ERK1/2，鈣離子/鈣調(diào)蛋白促進杯狀細胞分泌，保護黏蛋白層，維持眼表穩(wěn)態(tài)[51]。溶解素D2能夠上調(diào)cAMP，增加細胞內(nèi)鈣離子濃度，促進杯狀細胞分泌功能[52]。溶解素D1和E1能夠阻止鈣內(nèi)流，活化ERK1/2，控制炎癥環(huán)境中白三烯對杯狀細胞分泌的刺激[53]。這些研究都表明，溶解素可能成為杯狀細胞有效的調(diào)節(jié)劑，值得進一步關(guān)注。

Notch信號通路在腸道上皮分泌型或吸收型細胞的形成過程中起著決定性作用，可以通過信號通路引導(dǎo)細胞向特定方向分化，誘導(dǎo)結(jié)膜存在的干細胞向杯狀細胞分化，從而增加結(jié)膜杯狀細胞的數(shù)量。通過阻斷Notch級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致小腸中增殖性的隱窩細胞向有絲分裂后的杯狀細胞轉(zhuǎn)變[54]。在腸道或結(jié)膜中條件性地去除Notch調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子KLF4后，杯狀細胞就停止發(fā)育了[55]。而抑制Notch信號通路可以增加KLF4的表達、促進杯狀細胞分化以及減少腫瘤浸潤和增生，說明Notch信號通路和KLF4存在相互調(diào)控[56]。通過上述結(jié)果可以預(yù)測，抑制結(jié)膜上皮細胞的Notch信號通路將促進杯狀細胞的形成。需要注意的是，在角膜上皮細胞不可逆的失活Notch-1后，導(dǎo)致了角化增生，形成了一個血管化的不透明斑塊[57]。

近期有報道稱在小梁切除造成的結(jié)膜損傷中，活化CXCR3趨化因子受體增加了結(jié)膜杯狀細胞的數(shù)量，手術(shù)后在兔眼結(jié)膜下注射活化的趨化因子也增加了杯狀細胞的數(shù)量。杯狀細胞增加的具體機制還沒有闡明，但可能與兩方面有關(guān)，一是直接作用于杯狀細胞前體細胞，二是通過調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境產(chǎn)生間接作用，因為白內(nèi)障術(shù)后抑制炎癥反應(yīng)可以保留更多的杯狀細胞[58]。M1型巨噬細胞產(chǎn)生CXCR3的配體CXCL10，是應(yīng)對損傷的生理反應(yīng)之一，能夠在炎癥早期或者死亡配體存在的情況下保護前體細胞或干細胞[59]。盡管這方面研究尚淺，但也說明控制干眼的炎癥反應(yīng)將有效挽救杯狀細胞。

五、小結(jié)

隨著研究深入，杯狀細胞在干眼中的作用受到更多重視。不僅其分泌的黏蛋白是組成淚膜的重要成分，而且杯狀細胞還發(fā)揮著調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運等作用。雖然干眼中各種機制會導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細胞的丟失、分泌黏蛋白的減少，以及分泌的黏蛋白發(fā)生糖基化改變，加劇了干眼的惡性循環(huán)。但杯狀細胞前體細胞存在的可能性，和提高杯狀細胞數(shù)量的實驗基礎(chǔ)，為挽救杯狀細胞提供了理論依據(jù)。結(jié)膜組織、角膜緣組織或各種干細胞移植，發(fā)揮溶解素對杯狀細胞的調(diào)節(jié)作用，調(diào)控杯狀細胞分化的信號通路，改善眼部炎癥反應(yīng)微環(huán)境等方法，都將成為未來治療干眼的可能方向。