不同染色條件對COVID-19 Nucleocapsid抗體免疫組化染色的比較

吉佳樂，林 爽，曾 暉，姚馨悅，李 楊，何志承

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)是一種由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引發的強傳染性疾病，其通過呼吸道飛沫、氣溶膠及攜帶病毒的分泌物進行傳播。此外，無癥狀感染者也可能成為傳染源，給全球尤其是老人、有基礎性疾病的患者帶來了嚴重的健康危機。因此，該病的防控和治療至關重要。患者在感染COVID-19后期，部分組織器官可能會引發一系列復雜的生理變化和病理學癥狀[1]。姚小紅等[2]研究表明：COVID-19病變主要以肺部病變最明顯，免疫組化提示肺泡上皮細胞和巨噬細胞均存在COVID-19抗原表達，其還對腎臟、肝臟、心血管等其他臟器也有影響。免疫組化是病理診斷的重要輔助手段，可以幫助病理醫師在診斷過程中明確組織中抗原的表達位置及陽性細胞比例，并對其進行定位、定性及定量的研究[3]。因此，免疫組化在臨床病理診斷中不可替代，在COVID-19病理尸檢工作中也發揮重要作用。由于Nucleocapsid是COVID-19新研發抗體，暫無相關文獻報道，試劑盒說明書建議Western blot實驗中一抗稀釋濃度為1 ∶1 000～1 ∶5 000；酶聯免疫吸附實驗中一抗稀釋濃度為1 ∶5 000～1 ∶10 000；但對免疫組化的稀釋濃度及孵育條件無明確建議。本文現收集8例COVID-19尸檢肺組織標本，分別使用全自動免疫組化染色儀和手工免疫組化進行染色，探討其在不同操作條件下的免疫組化染色情況，以便得到定位準確、背景清晰的染色切片，更好地為COVID-19的病理診斷和臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年3～6月陸軍軍醫大學第一附屬醫院病理科8例COVID-19尸檢石蠟包埋組織，以2.5 μm厚連續切片15張，85 ℃烤片30 min備用[4]。將COVID-19的Nucleocapsid抗體，分別按1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000的比例進行稀釋備用。

1.2 主要試劑及儀器COVID-19的Nucleocapsid(40143-R019)抗體，購自北京義翹神州公司。EDTA修復液和檸檬酸修復液(MVS-0100)，均購自福州邁新公司。OptiView DAB IHC Detection Kit和Roche BenchMark全自動免疫組化染色機，購自美國Ventana公司。

1.3 HE染色及免疫組化

1.3.1HE染色 將備好的組織切片進行HE染色，具體流程如下：將切片脫蠟、脫水，蘇木精染色 5 min，1%鹽酸酒精分化數秒，1%氨水返藍 2 min，水洗后再用伊紅染色 1 min，切片經脫水、透明、封固，光鏡下觀察。

1.3.2全自動免疫組化儀染色 將備好的組織切片放入Roche BenchMark XT全自動免疫組化染色儀中，設定相應程序進行染色。程序設定如下：75 ℃條件下烤片4 min；EZ Prep溶液76 ℃脫蠟4 min；Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復液99 ℃修復36 min；抑制劑孵育45 min；加入一抗100 μL，36 ℃孵育32 min；Reaction Buffer Concentrate(10×)緩沖液清洗5 min；二抗37 ℃孵育8 min；DAB顯色8 min，蘇木精II襯染12 min，返藍液返藍4 min，脫水、透明、封固。

1.3.3手工免疫組化染色 組織切片經二甲苯-二甲苯-100%乙醇-100%乙醇-95%乙醇-75%乙醇常規脫蠟、水化、蒸餾水浸泡。采用高溫高壓修復，用檸檬酸(或EDTA)修復液修復2.5 min。自然冷卻后置于3%H2O2中，37 ℃ 10 min，PBS沖洗3 min×3次。加入一抗，4 ℃孵育過夜(或37 ℃孵育1 h )，PBS沖洗3 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色，蘇木精復染3 min，酸化后返藍、脫水、透明、封固。

1.4 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測將標本制備成厚度為100 nm的超薄切片，染色后用透射電子顯微鏡(日立HT7700，電壓 100 kV)觀察超微結構變化。提取的檢測標本RNA用RT-PCR試劑盒(8.0131901X024E，廈門艾德生物公司)進行核酸檢測。透射電鏡掃描、核酸檢測與免疫組化檢測，均來自同一例尸檢的肺組織標本。

2 結果

2.1 HE染色HE染色結果清晰可見肺泡上皮稍增生，肺泡腔內可見分泌物及出血，肺泡間隔增寬，纖維組織增生并見少量中性粒細胞浸潤(圖1A)。

2.2 全自動免疫組化染色儀最佳染色條件本科室采用Roch BenchMark全自動免疫組化染色平臺，設置不同一抗濃度為1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000和陰性對照的4個組別。結果顯示：陰性對照組的組織待檢細胞無陽性信號(圖1B)，提示COVID-19的Nucleocapsid抗體表達有特異性。在不同濃度的一抗中發現COVID-19的Nucleocapsid 抗體在肺泡Ⅱ型上皮細胞均呈陽性。其中，稀釋比為1 ∶2 000(圖1C)和1 ∶4 000(圖1D)組的非特異性著色較為明顯，稀釋比為1 ∶8 000組陽性細胞染色更加清晰，特異性較高(圖1E)；高倍鏡下視野可清晰觀察到肺泡Ⅱ型上皮細胞呈陽性(圖1F)。以上結果提示：全自動免疫組化染色儀檢測COVID-19的Nucleocapsid抗體，按稀釋比為1 ∶8 000可取得較好的染色效果。

ABCDEF

2.3 手工免疫組化最佳染色條件在進行手工免疫組化染色時，本組分別設置了不同的抗原修復條件、抗體孵育方式及一抗濃度。結果顯示采用EDTA對抗原進行修復后，陽性細胞的著色強度明顯高于檸檬酸修復，但其特異性較差，陽性著色部位不夠明確。進一步通過不同方式進行一抗孵育，結果顯示一抗4 ℃孵育過夜的染色效果優于37 ℃孵育1 h，其非特異性著色相對較少。在不同一抗濃度差異分析中發現，組織非特異性著色隨著一抗稀釋比的增加而逐漸降低，但是一抗1 ∶8 000稀釋濃度未見陽性信號。因此，推薦采用1 ∶4 000的一抗稀釋濃度。此外，陰性對照組無陽性信號。根據不同染色條件結果顯示：手工免疫組化染色檢測COVID-19的Nucleocapsid抗體時，最佳染色條件為檸檬酸修復、一抗4 ℃過夜孵育、一抗稀釋比為1 ∶4 000(圖2)。

ABCDEFGH

2.4 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測將8例COVID-19尸檢組織分別使用電鏡掃描和核酸檢測對免疫組化染色結果進行驗證，發現病毒顆粒和PCR檢測病毒陽性(圖3)，提示待檢樣本染色陽性的可靠性。

圖3 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測：A.透射電鏡掃描顯示肺組織內有病毒顆粒；B.COVID-19核酸檢測為COVID-19陽性；紅色是HEX通道，顯示內參基因；藍色是ROX通道，顯示COVID-19開放閱讀框1 ab基因的保守區域；綠色是FAM通道，顯示COVID-19衣殼蛋白基因的保守區域

3 討論

COVID-19具有高度傳染性，其周期性大暴發及國際性傳播對全球的公共衛生和經濟發展構成重大的威脅，有效的防控和治療至關重要。Bian等[5]研究發現：患者感染SARS-CoV-2后，將導致多處器官和組織受損傷，并伴明顯的肺部病變。Yao等[6]通過電鏡在肺Ⅱ型上皮細胞內發現直徑為70～100 nm的新型冠狀病毒顆粒，肺部組織切片經免疫組化染色后也證實在肺組織中存在SARS-CoV-2病毒。免疫組化是指利用抗原抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(如熒光素、酶、金屬離子和同位素)顯色，以確定組織細胞內的抗原，并對其進行定位、定性及半定量的研究[7]。高質量的免疫組化染色效果更有利于結果的判讀，對推進COVID-19病理機制的研究具有重要意義。免疫組化染色過程中的切片制備、抗原修復、抗體濃度及孵育條件、顯色等各個環節均可能影響最終的結果，故探索其最優染色條件至關重要。

研究報道[8]，由于COVID-19標本的特殊性，固定時間以48 h最佳，病毒標本必須間隔1 cm切開，并使用5～10倍固定液充分固定后再進行后續實驗。此外，在切片制備過程中，要根據標本的類型選擇合適的厚度。本組選用的是肺組織標本，切片過薄容易丟失部分抗原信號，過厚容易出現細胞堆積導致染色過深影響判讀，且在高溫高壓抗原修復時容易掉片，故應選擇適宜的厚度(3 μm)進行切片。烤片時溫度不高于70 ℃，同時保持切片干燥，有利于組織和撥片充分粘合。由于前期經10%中性福爾馬林固定形成醛鍵，遮蔽抗原決定簇，干擾抗原與抗體的特異性結合，行免疫組化染色時需進行抗原修復，使抗原決定簇充分暴露[9]；但修復方式和修復液選擇不當，均可能出現假陽性或假陰性。劉智等[10]研究證實，高溫高壓修復優于微波抗原修復，而檸檬酸(pH 6.0)和EDTA(pH 9.0)兩種不同修復液也會影響免疫組化染色結果。因此，需要進行預實驗對COVID-19的Nucleocapsid抗體最佳修復方式進行摸索。為去除細胞中殘留的雜蛋白、內源性酶等，常使用過氧化物酶封閉液破壞酶活性，避免非特異性著色[11]。本實驗結果提示：相同修復條件下使用同濃度抗體進行檢測時，全自動免疫組化染色儀的染色效果優于手工免疫組化，特異性著色也相對較少，原因可能是Roche BenchMark全自動染色儀采用噴射式清洗技術，可均勻徹底的清洗切片，使染色背景更干凈，染色結果更為清晰。此外，抗原抗體特異性結合達到平衡終點需要一定的溫度、時間和濃度，故探討抗體的孵育時間、溫度和一抗濃度也至關重要。研究證明[12]：陽性細胞強度隨一抗孵育溫度升高而增強，但陽性細胞數量與孵育溫度無直接關系，溫度過高反而會降低抗原抗體結合效率。本實驗結果顯示，一抗4 ℃過夜孵育的染色質量優于37 ℃ 孵育1 h的染色質量，其染色清晰、著色均勻、特異性更高，提示手工免疫組化染色經4 ℃孵育更有利于抗原抗體的有效結合。本實驗還發現全自動免疫組化染色儀和手工免疫組化染色的抗體特異性，均隨著一抗濃度的增加而降低，兩者最佳染色濃度分別為1 ∶8 000和1 ∶4 000，提示抗原抗體結合不僅受外界環境的影響，而且與抗體自身的濃度也顯著相關，濃度太高或太低，都會影響抗原抗體的結合反應。除一抗濃度外，二抗的稀釋比例和顯色時間對染色結果也至關重要，二抗濃度過高或顯示時間過長，均會出現著色較深、非特異性著色增加的現象。因此，對于新抗體一定要摸索出最佳染色條件后再進行實驗，以得到更為優化、準確的結果。

隨著越來越多新型抗體的出現，免疫組化染色結果在病理診斷、預后判斷、指導治療等方面發揮重要作用。在全球COVID-19暴發的特殊時期，準確的組織病理學診斷結果將有助于學者對該病毒感染機制的進一步分析，為后期疫苗和臨床治療藥物的研發、診治方案優化提供科學依據。因此，制作一張高質量的免疫組化染色切片也將為COVID-19的研究和臨床診斷治療提供必要的參考。