淚腺腺樣囊性癌中MYB蛋白表達及分子遺傳學特征分析

劉 輝，任雨潔，楊菁茹，李元朋，蔡鳳梅，夏益敏，王卉芳

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是好發于涎腺的惡性腫瘤[1]，淚腺ACC與涎腺ACC相比，臨床更為罕見。淚腺ACC常可侵犯眼眶周圍組織，因眼眶解剖部位的特殊性，手術常無法完整切除且易發生局部復發和遠處轉移，患者10年生存率約52%[2]。近年研究發現在涎腺ACC中普遍存在MYB、MYBL1和NFIB基因易位[3-7]，且MYB蛋白在ACC中過表達，具有較高的敏感性和特異性。既往研究多集中在涎腺ACC，而淚腺ACC報道較少。本文收集16例淚腺ACC和20例淚腺非ACC，采用免疫組化EnVision法和FISH法檢測MYB蛋白表達及MYB基因易位，聯合MYB蛋白表達和分子遺傳學改變為淚腺ACC的診斷提供更多病理學依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年9月～2020年9月陜西省西安市人民醫院(西安市第四醫院)手術切除淚腺ACC標本16例和淚腺非ACC標本20例(包括淚腺混合瘤12例、淚腺惡性混合瘤6例、淚腺腺癌1例、淚腺腺泡細胞癌1例)。所有病例均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療，由兩位經驗豐富的病理醫師重新閱片。根據ACC組織學類型對其進行分級：Ⅰ級以管狀或篩狀結構為主，無實性成分；Ⅱ級為管狀、篩狀和實性成分均有，且實性成分≤30%；Ⅲ級為管狀、篩狀和實性成分均有，且實性成分>30%。收集所有病例的臨床資料，隨訪截至2020年9月，時間為1個月～5年。

1.2 免疫組化檢測及結果判定免疫組化采用EnVision法染色，兔單克隆抗體MYB(1 ∶200)購于美國Abcam公司，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。MYB陽性結果判讀標準：MYB陽性定位于細胞核，呈棕黃色顆粒。(1)按陽性細胞著色程度計分：未著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比計分：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項評分相乘：0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為中等陽性，9～12分為強陽性。

1.3 FISH檢測及結果判定FISH檢測MYB基因易位：石蠟包埋組織，4 μm厚連續切片，常規脫蠟水化，晾干。雜交前處理，變性及雜交，探針為MYB(6q23)基因斷裂探針(廣州安必平公司)；雜交后洗滌，熒光顯微鏡下觀察切片，4 ℃保存切片等，實驗流程按試劑盒說明書進行。FISH結果判定：無MYB基因易位的細胞核中顯示2個緊密相鄰的紅、綠信號，或有疊加的部分呈黃色；有MYB基因易位的細胞核則顯示至少1對紅、綠分離信號，且紅、綠信號分離間距≥2個信號點直徑距離。由于切面原因，會出現部分信號丟失現象，因而只計數信號完整(2紅、2綠)的細胞。選取20個視野(1 000倍)，計數200個細胞核，陽性細胞核比例≥30%時為陽性；<10%時為陰性；≥10%且<30%時為不確定病例，需進行其他驗證。本組未見不確定病例。

1.4 統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料采用n(%)表示，組間總體分布趨勢比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法，組間兩兩比較采用Bonferrion矯正法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征16例ACC患者年齡19～74歲，平均49歲，男女比為5 ∶11，腫瘤最大徑0.8～4.5 cm，平均2.6 cm。淚腺ACC患者臨床表現主要為眼部腫物，部分患者伴眼瞼水腫或疼痛流淚。影像學多表現為明顯的眼眶內腫物，部分病例邊界不清，腫瘤組織破壞周圍骨組織呈侵襲性生長，其中2例伴淋巴結轉移。隨訪時間1個月～5年，4例患者出現局部復發，隨訪患者均無死亡(表1)。

表1 淚腺ACC臨床病理資料及免疫組化和FISH檢測

2.2 病理特征淚腺ACC組織主要由導管細胞和肌上皮細胞構成，形成管狀、篩狀或實性結構，篩孔內可見嗜堿性黏液樣物質(圖1、2)，并可見神經侵犯(圖3)。按病理學分級：16例淚腺ACC中Ⅰ級5例，以管狀或篩狀結構為主，無實性成分；Ⅱ級9例，有管狀、篩狀和實性成分，且實性成分≤30%；Ⅲ級2例，有管狀、篩狀和實性成分，且實性成分>30%(表1)。部分病例腫瘤細胞也可見條索狀排列。

2.3 MYB蛋白表達免疫組化EnVision法檢測MYB蛋白在淚腺ACC組織中呈細胞核陽性著色，16例淚腺ACC中強陽性5例(表1，圖4、5)，中等陽性11例(圖6)。淚腺ACC中MYB蛋白表達與腫瘤大小、病理分級、復發轉移及患者預后均無關(P>0.05)。MYB蛋白在淚腺ACC組和非ACC組中的陽性率分別為100%(16/16)和0(0/20)，差異有顯著性(P<0.01)。

2.4 MYB基因易位FISH法檢測16例淚腺ACC組織中有14例標本存在MYB基因易位(表1)，表現為紅綠信號分離(圖7)，陽性率為87.5%(14/16)。2例患者FISH檢測陰性，但MYB蛋白免疫組化檢測均呈中等陽性。淚腺ACC中MYB基因易位與腫瘤大小、病理分級、復發轉移及患者預后均無顯著相關性(P>0.05)。20例淚腺非ACC標本中均未檢測到MYB基因易位，差異有顯著性(P<0.01)。

①②③④⑤⑥⑦圖1 腫瘤組織呈篩狀排列,腔內可見嗜堿性分泌物,可見正常淚腺組織(箭頭) 圖2 淚腺ACC腫瘤細胞呈實性排列圖3 腫瘤細胞呈條索狀排列并侵犯神經組織 圖4 MYB在ACC細胞核呈強陽性,EnVision法 圖5 MYB在淚腺ACC組織中呈彌漫強陽性,EnVision法 圖6 MYB在淚腺ACC部分腫瘤細胞呈中等陽性,EnVision法 圖7 FISH檢測淚腺ACC中MYB發現基因斷裂

3 討論

MYB屬于原癌基因，編碼核轉錄因子c-MYB，文獻陸續發現MYBL1(a-MYB)和MYBL2(b-MYB)，三者均為MYB轉錄因子家族成員。研究發現MYB在細胞增殖、分化和血管生成等方面發揮重要作用[8]，c-MYB在白血病、結腸癌、乳腺癌和肝癌中均存在過表達。目前，研究顯示ACC常發生t(6；9)(q22-23；p23-24)染色體易位，MYB和NFIB發生融合，形成MYB-NFIB融合基因，參與ACC的發生、發展[3-7]。WHO(2017)頭頸部腫瘤分類將t(6；9)(q22-23；p23-24)染色體易位作為涎腺ACC特征性的分子遺傳學改變，在涎腺ACC診斷中具有較高的敏感性和特異性。

ACC多見于涎腺，也可發生于淚腺、乳腺、肺和皮膚等部位[9-11]。既往研究多集中在涎腺和乳腺等常見部位的ACC，淚腺和肺等少見部位ACC分子改變報道較少[3,11-14]。淚腺ACC常需與淚腺部位其他腫瘤鑒別，特別是淚腺多形性腺瘤、上皮-肌上皮癌和癌在多形性腺瘤等，可利用MYB基因易位在ACC中的高敏感性和特異性進行鑒別診斷。Chen等[12]收集12例淚腺ACC和25例非ACC良性唾液腺組織，在淚腺ACC中MYB基因易位陽性率為58%(7/12)，在非ACC組織中并未發現MYB基因易位。von Holstein等[3]采用分離探針檢測14例淚腺原發ACC和19例非ACC，結果發現7例淚腺ACC存在MYB基因易位，陽性率為50%，非ACC中并未檢測到MYB基因易位。Andreasen等[13]收集64例涎腺、淚腺和乳腺ACC，其中9例淚腺ACC經FISH檢測后發現5例存在MYB-NFIB融合基因。MYB基因易位在淚腺ACC中具有較高的敏感性和特異性，由于其病例數較少，尚需積累更多病例進一步分析。本組收集16例淚腺ACC，采用MYB斷裂基因進行FISH檢測，結果發現其陽性率為87.5%(14/16)，在20例淚腺非ACC中并未檢測MYB易位，與文獻報道一致。

雖然MYB基因易位在ACC中具有較高的敏感性和特異性，但分子遺傳學檢測MYB陰性的病例并不能完全除外ACC。近年研究顯示ACC中還有其它融合基因[6,11,15-19]，同時不同檢測材料和方法也影響檢測結果。Brill等[14]通過RT-PCR法檢測MYB-NFIB融合基因在頭頸部ACC中的陽性率，在石蠟組織和冷凍組織中的陽性率分別為44%(14/32)和86%(25/29)。Togashi等[16]采用FISH、RT-PCR和RNA Sequence等方法檢測100例ACC，結果顯示其中73例存在MYB基因易位，24例存在MYBL1基因易位，陽性率為97%(97/100)，作者發現陽性病例表現形式多樣，如果僅使用斷裂探針檢測陽性率僅為87%(87/100)，MYB斷裂探針和MYB-NFIB融合探針雙陽性57例，MYB斷裂探針陽性而MYB-NFIB融合探針陰性12例，MYB-NFIB融合探針陽性而MYB斷裂探針陰性3例。此外，還發現在MYBL1陽性病例中MYBL1斷裂探針和MYBL1-NFIB融合探針雙陽性18例，MYBL1斷裂探針陽性而MYBL1-NFIB融合探針陰性5例，MYBL1斷裂探針陰性而MYBL1-NFIB融合探針陽性2例。Fujii等[19]采用斷裂探針和融合探針檢測33例ACC，其中16例MYB-NFIB、4例MYB-X、2例MYBL1-NFIB、1例MYBL1-X、6例NFIB-X和4例陰性，陽性率為88%(29/33)。Pei等[11]收集7例氣管支氣管部位ACC，并采用RNA Sequence檢測發現MYB-NFIB、MYBL1-NFIB、MYBL1-RAD51B融合基因。由此可見，雖然MYB在ACC中具有較高的特異性，但仍有MYBL1等其他基因突變，且突變的表現形式多樣，特別是對于MYB基因易位陰性的病例，仍不能完全排除ACC的可能性，需要檢測其他可能存在的基因突變。

關于淚腺ACC是否也具有以上各種基因易位情況，由于標本量少，目前僅有少量相關研究。Andreasen等[13]認為淚腺ACC的基因突變高度集中于MYB和NFIB，而MYBL1則主要發生于唾液腺ACC中。Togashi等[16]收集4例淚腺ACC，在其中1例中發現MYBL1斷裂探針陰性而MYBL1-NFIB融合基因陽性。Pei等[11]報道7例氣管支氣管部位ACC中發現MYBL1-NFIB和MYBL1-RAD51B融合基因。Chen等[12]用MYB斷裂基因FISH法檢測淚腺ACC，作者認為陰性病例仍不能除外ACC可能性。本實驗中用MYB斷裂基因檢測的16例淚腺ACC有14例陽性，2例陰性，但不能完全除外ACC。目前，多數文獻報道認為MYB的免疫組化法檢測比分子檢測具有更高的敏感性，部分分子檢測陰性的ACC也存在MYB蛋白過表達。本組中2例FISH檢測MYB陰性的病例也出現了MYB蛋白中等陽性，與既往報道一致。也有研究顯示部分非ACC中也出現MYB蛋白的表達[14,20-21]。本組20例淚腺非ACC組織中，并未發現MYB蛋白強陽性，ACC的診斷仍應結合MYB免疫組化和分子檢測結果綜合分析。對于ACC分子遺傳學改變與病理分級和臨床特征之間的相關性，仍存在爭議。Chen等[12]認為淚腺ACC中MYB基因易位與病理特征及患者預后無關，而Togashi等[16]研究顯示MYB/MYBL1基因易位與病理分級有相關性。淚腺ACC中的研究因局限于少數病例，并無大樣本分析，缺乏有力證據。本實驗有16例患者FISH檢測MYB基因易位結果，與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、病理學分級和預后均無相關性。

淚腺ACC比涎腺ACC臨床更為少見，但同樣具有特異性的MYB基因易位和MYB蛋白高表達，需聯合免疫組化和FISH檢測進行診斷。本組淚腺非ACC的惡性腫瘤較少，特別是淚腺腺癌及淚腺腺泡細胞癌均為1例，不能完全除外其他非ACC的淚腺惡性上皮性腫瘤也有MYB蛋白表達或FISH檢測MYB基因易位的可能，需進一步分析。同時，FISH檢測只采用了斷裂探針，并未同時檢測其他可能存在的融合基因，不能除外其他基因易位的可能性，具有一定局限性。