HPLC法測定蘇格木勒-10中5種成分

良 良，陳香梅，鮑布日額，張媛媛，王秀蘭

(內蒙古民族大學,內蒙古 通遼 028005)

蘇格木勒-10是始載于《四部醫典》的主治腎寒、尿閉、結石病的蒙藥復方[1]，由益智、干姜、白硇砂、蓽茇等10味藥材組成，療效顯著[2-3]。方中君藥益智中的圓柚酮、楊芽黃素[4]具有保護腎臟，抗腫瘤增殖和促凋亡[5]，抗炎[6]和抗應激[7]，抑制炎癥、凋亡和自噬[8-10]，調節免疫等作用，可用于多種腎臟疾病的治療；使藥干姜所含6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚具有抗心腎損傷[11-12]，抗炎[13]，抑制腫瘤活性，抗氧化[14]，抗卵巢癌[15-16]作用。目前。關于蘇格木勒-10質量研究的報道集中在個別單藥單一成分含量測定上[17-19]，難以完整系統地體現該蒙藥方劑成分的多樣性。因此，本實驗采用HPLC法測定方中君藥益智主要成分圓柚酮、楊芽黃素，以及使藥干姜主要成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，以期為完善其質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ULMATE3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Nikon E200電子顯微鏡、DS-U3拍照裝置(北京恒三江儀器銷售有限公司)；T-1700M馬弗爐(鄭州天縱電氣設備有限公司)；DHG-9023A電熱恒溫箱(寧波江南儀器廠)；AUY-120電子天平(最大210 g，感量0.01 mg，日本島津公司)；KQ-100E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MILLIPORE型純水機[序列號SH3CA00008A，默克密理博實驗室設備(上海)有限公司]；0.22 μm微孔濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司)；RE-52旋轉蒸發器(功率50 W)、B220恒溫水浴鍋(功率1 000 W)(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試劑與藥物 6-姜酚(批號191115，純度≥98%)、8-姜酚(批號200204，純度≥98%)、10-姜酚(批號190513，純度≥98%)對照品均由北京北納創聯生物技術研究院提供；諾卡酮(批號A10J10R79508，純度≥98%)、楊芽黃素(批號Z17O8X44888，純度≥98%)對照品均由上海源葉生物科技有限公司提供。乙腈為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；其余試劑均為分析純；水為超純水。

益智仁(批號20190512，產地安徽)、干姜(批號20190904，產地安徽)、榧子(批號20200807，產地安徽)、白硇砂(批號20200322，產地新疆)均購自安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司；蓮子(批號20200127，產地湖南)、蓽茇(批號20190521，產地廣西)均購自安徽中美堂中藥飲片有限公司；冬葵果(批號20170768，產地河北)、苦石蓮(批號20200207，產地四川)、方海(批號20200121，產地山東)均購自安國市彤康藥業有限公司；麝香(批號20140704，產地河北)購自河北省菁草堂醫藥貿易有限公司)，上述藥材經內蒙古民族大學蒙醫藥學院鮑布日額教授鑒定為正品。

按《中華人民共和國衛生部藥品標準》(蒙藥分冊1998)[18]記載，稱取益智、方海各150 g，干姜、白硇砂、蓽茇、榧子、冬葵果、蓮子、苦石蓮各60 g，麝香0.1 g，制成蘇格木勒-10(S11)，其余11批(S1～S10、S12)購于10家醫院制劑室，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8.5 min，30%～35%A，70%～65%B；8.5～10 min，35%～30%A，65%～70%B；10～22 min，30%A，70%B)；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；檢測波長205 nm。

2.1.2 圓柚酮、楊芽黃素 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8.0 min，30%～27%A，70%～73%B；8.0～12 min，27%～22%A，73%～78%B；12～17 min，22%～27%A，78%～73%B；17～20 min，27%～30%A，73%～70%B)；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長238 nm；進樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對照品適量，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容，搖勻，得質量濃度分別為2 000、2 000、1 000、2 000、2 000 μg/mL的貯備液，再分別進一步稀釋至200、200、103.13、200、200 μg/mL，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取全方(S11)粉末5 g，置于200 mL圓底燒瓶中，加75%甲醇100 mL，超聲(功率100 W)處理30 min，濾過，濾液減壓濃縮，冷卻至室溫，甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按全方工藝分別制備缺益智、缺干姜的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 精密量取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果圖1～2。由此可知，在該色譜條件下各成分均能達到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數以6-姜酚峰計均不低于8 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

1.楊芽黃素 2.圓柚酮1.tectochrysin 2.nootkatone圖1 楊芽黃素、圓柚酮HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of tectochrysin and nootkatone

1.6-姜酚 2.8-姜酚 3.10-姜酚1.6-gingerol 2.8-gingerol 3.10-gingerol圖2 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 6-gingerol,8-gingerol and 10-gingerol

2.3.2 線性關系考察 精密稱取對照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，分別精密量取5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 取供試品溶液5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積RSD分別為1.33%、1.47%、1.29%、2.14%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、6、8、10、24、36 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積RSD分別為1.11%、1.86%、2.50%、2.20%、1.92%、1.21%，表明溶液在36 h內穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取全方(S11)6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量RSD分別為1.73%、1.12%、2.16%、1.76%、1.47%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的全方(S11)9份，每份2.5 g，分別按1.5∶1、1∶1、0.5∶1比例加入對照品(圓柚酮793.5、529、264.5 μg/g，楊芽黃素3.57、2.38、1.19 μg/g，6-姜酚175.05、116.7、58.35 μg/g，8-姜酚23.38、15.6、7.78 μg/g，10-姜酚8.72、5.81、2.91 μg/g)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均加樣回收率分別為99.09%、88.72%、100.74%、96.80%、95.08%，RSD分別為0.84%、1.42%、1.11%、3.03%、1.12%。

2.3.7 樣品含量測定 取12批全方(S1～S12)，每份5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定3次，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果(μg/g，n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents(μg/g,n=3)

3 討論與結論

本實驗根據文獻[13，19-20]對5種成分進行波長篩選，發現6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在205 nm處均有吸收峰，并且6-姜酚、8-姜酚有較大吸收，而圓柚酮、楊芽黃素在238 nm處吸收較好。因此，在保證各成分檢測靈敏度及基線分離的情況下，選擇205、238 nm作為檢測波長。然后，考察了乙腈/甲醇與水/水(含磷酸)的組合，發現乙腈-水(含磷酸)的洗脫能力更優，并且磷酸體積分數為0.2%時無拖尾，故選擇其作為流動相。再考察了75%甲醇、95%乙醇的提取效果，發現其中前者提取時峰面積、基線穩定性、噪聲、分離度優于后者，而且超聲提取相較于回流提取，具有峰面積大、基線平穩、噪聲小、分離度理想、雜峰少、操作簡便的優點。

含量測定結果顯示，12批蘇格木勒-10中圓柚酮、6-姜酚含量均較高，楊芽黃素、10-姜烯酚含量相當，8-姜酚含量均較低；S4中8-姜酚含量明顯低于其他批次；S11中圓柚酮、10-姜酚含量最高；S7中楊芽黃素含量最高；S2中6-姜酚含量最高；S3中8-姜酚含量最高。雖然上述成分含量差異較大，但因它們為方中君藥益智、使藥干姜的主要活性成分[17,19-21]，故仍將其作為檢測指標。

綜上所述，本實驗首次建立HPLC法測定蘇格木勒-10中圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，該方法簡便準確、專屬性、重復性良好，檢測成本低，可為完善和提高該方質量標準提供依據。