左歸丸對卵巢切除骨質疏松癥模型小鼠骨代謝的機制

李 微，徐紅丹，宋 肖，張 博，趙文豪，邵 帥，黃樹明*

(1.湖北文理學院醫學院，湖北 襄陽 441053；2.黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；3.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨質疏松癥是一種常見的全身系統性的骨骼退行性病變，多發生在老年群體，尤其是絕經后的老年女性[1]。隨著老齡人口的增多，骨質疏松癥的發病率出現了逐年攀升的趨勢，引起了社會和醫學領域的廣泛關注。骨質疏松癥的產生有多方因素，包括性激素的減少、鈣離子的流失、身體各器官機能的減退、內分泌的失調以及其他疾病和藥物誘導等因素。該病嚴重影響著中老年人甚至年輕人的身體健康與生活質量，給社會造成極大的負擔。因此，急需找到預防和治療這類疾病的有效措施。

補腎法是根據傳統中醫理論制定的臨床預防和治療骨病的基本治則，中醫學認為“腎在體為骨，骨乃腎所主”，故“腎主骨”理論是研究人員選則用藥的主要理論依據[2-3]。本課題選用補腎古方左歸丸，該方是由熟地、山藥、山茱萸、枸杞、菟絲子、川牛膝、龜板膠、鹿角膠、八味中藥組成，其功效為滋陰補腎，填精益髓，且諸多實驗研究證實，其對骨質疏松癥，生殖、內分泌、免疫系統、神經系統等均有保護作用[4-5]。本研究采用雌激素剝奪的方法建立絕經后骨質疏松小鼠模型[6]，探究左歸丸通過雌激素/雌激素受體途徑影響骨代謝的機制，為臨床上采用補腎法治療骨質疏松癥提供實驗依據，同時也為骨質疏松癥的治療提供新的思路和方向。

1 材料

1.1 動物 清潔級未孕雌性小鼠72只，C57BL/6品系，8～10周齡，由黑龍江中醫藥大學GLP實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(黑)2013-0004。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 MUTISKANMK3型酶標儀、-80 ℃冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CT15RE型4 ℃低溫離心機(日本Hitachi公司)；PH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；制冰機(常熟市雪科電器有限公司)；SVC-1000型全自動交流穩壓器(浙江常安集團有限公司)；制膠工具、電泳儀、多層濾紙、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；半干轉膜電泳儀、移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2.2 試劑 小鼠雌二醇(E2)酶聯免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(貨號P0013B)、PMSF(貨號ST506)、超敏ECL發光液(貨號P0 018 A)(上海碧云天生物技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號PC0020)、4×蛋白上樣緩沖液(貨號P1015)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號P1300)(北京索萊寶科技有限公司)；5×SDS loading Buffer(貨號S0137)、Western一抗稀釋液(貨號M3001)、Western二抗稀釋液(貨號M3101)(哈爾濱海基生物科技有限公司)；乙二胺四乙酸[福晨(天津)化學試劑有限公司]；十二烷基硫酸鈉、吐溫80、甘氨酸、Tris-HCL、Tris-base、TRIS、Base(天津市光復精細化工研究所)；PBS緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液(武漢塞維爾生物科技有限公司)；甲醇(天津市富宇精細化工有限公司)；脫脂奶粉(內蒙古伊利實業集團股份有限公司)；PVDF膜、預染蛋白Marke(貨號26616)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；聚合HRP標記抗兔lgG(貨號SV0002)(武漢博士德生物工程有限公司)；ERα Antibody(貨號AF6058)(美國Affinity公司)；ERβ Antibody(貨號bs-0116R)、鼠抗β-actin單克隆抗體(貨號bs-0061R)(北京博奧森生物技術有限公司)；DAB顯色試劑盒(貨號WLA022a)(沈陽萬類生物科技有限公司)。

1.2.3 水煎液制備及劑量確定 左歸丸組方藥材熟地20 g、枸杞10 g、牛膝7.5 g、山茱萸10 g、鹿角膠10 g、山藥10 g、龜板膠10 g、菟絲子10 g，均購自哈藥集團世一堂中藥飲片有限責任公司，經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為正品，制成水煎液，方法為取出鹿角膠和龜板膠，其余藥材用自來水浸泡30 min后煎制2次，合并藥液，加入打成粉的鹿角膠和龜板膠進行煬化處理，攪拌均勻后濃縮成固定體積的貯備液。陽性對照藥采用戊酸雌二醇片(補佳樂)(批號214 A)[拜耳醫藥(上海)有限公司]。成人日用量1 mg，換算成小鼠為每天0.13 mg/kg，小鼠每天灌胃容量為0.01 mL/g，雌二醇溶液含藥量為0.013 mg/mL，配制好后置于4 ℃冰箱中貯存備用。氟維司群ICI82780(貨號129453-61-8)(美國Selleck公司)。成人的臨床用量為每個月肌內注射250 mg，換算成小鼠給藥劑量為每個月32 mg/kg，本實驗按照2倍成人劑量給藥，即64 mg/kg。

2 方法

2.1 分組、建模及取材 采用雙側卵巢摘除的方法制備骨質疏松癥小鼠模型，造模1個月后隨機分模型組，雌二醇組，左歸丸高、中、低劑量組，阻斷劑組，每組12只，按0.01 mL/g體質量灌胃給藥，左歸丸成人臨床服用的劑量為9 g/次，每天2次，換算成小鼠給藥劑量為每天2.34 g/kg，灌胃容量為0.01 mL/g。左歸丸高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予質量濃度為0.936、0.468、0.234 mg/mL的左歸丸水煎液，假手術組、模型組小鼠灌胃給予等容量生理鹽水，雌二醇組小鼠灌胃給予0.013 mg/mL相應溶液，阻斷劑組肌肉注射64 mg/kg ICI182780后按照左歸丸高劑量組劑量給藥，各組均連續給藥8周。

給藥8周后，小鼠稱定體質量，摘取眼球取血，室溫下靜置30 min，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存備用，取血后取出脛骨、股骨、L4-6段腰椎骨，脛骨置于4 ℃冰箱中，用4%多聚甲醛固定48 h；股骨迅速放置于液氮中速凍后，移至-80 ℃冰箱中；L4-6段腰椎骨用浸生理鹽水的紗布包裹，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 脛骨組織中ER表達 取出固定的小鼠脛骨組織，放入EDTA溶液中進行脫鈣處理，用常規方法(脫水、透明、浸蠟)石蠟包埋，切片(厚度4 μm)，采用免疫組織化學法檢測小鼠脛骨近心端ERα、ERβ的表達。

2.3 股骨組織中ER蛋白表達 取出凍存的小鼠股骨組織，采用Western blot法檢測小鼠股骨中ERα、ERβ蛋白表達。

2.4 雌激素受體阻斷劑對左歸丸骨代謝作用的干預作用 ICI182780干預后，測定小鼠骨密度、骨代謝相關因子、ERα蛋白表達，具體實驗方法如前期報道所述[1]。

3 結果

3.1 左歸丸對小鼠脛骨中ER表達的影響 電子顯微鏡下觀察到雌激素受體陽性表達呈棕黃色或黃褐色的顆粒，胞質和胞核均有表達，蛋白表達量越多，顏色越深，見圖1A～1B。模型組小鼠脛骨骨松質部分ERα、ERβ表達均低于假手術組(P<0.01)；與模型組比較，雌二醇組及左歸丸高、中劑量組小鼠ERα表達升高(P<0.05，P<0.01)，雌二醇組及左歸丸高劑量組小鼠ERβ表達升高(P<0.01)，見圖1C。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組小鼠脛骨骨松質ER表達(免疫組化DAB染色，×400)

3.2 蛋白質免疫印跡實驗 圖2顯示，模型組小鼠股骨ERα、ERβ蛋白表達低于假手術組(P<0.01)，表明卵巢摘除后雌激素水平下降，雌激素受體表達減少；與模型組小鼠比較，雌二醇組及左歸丸高、中、低劑量組均可使小鼠ERα表達增加(P<0.05，P<0.01)，雌二醇組小鼠ERβ表達升高(P<0.01)，但左歸丸各劑量組無明顯差異(P>0.05)。

3.3 雌激素受體阻斷劑對左歸丸骨代謝作用的影響 表1顯示，與左歸丸組比較，左歸丸+阻斷劑組小鼠骨密度減少(P<0.01)，ALP、StrACP活性及OC水平升高(P<0.05，P<0.01)。圖3顯示，與左歸丸組比較，左歸丸+阻斷劑組小鼠ERα受體減少，其灰度比值與左歸丸組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 各組小鼠股骨ERα、ERβ蛋白表達

表1 ICI182780干預后各組小鼠骨密度及骨代謝相關因子水平

注：與模型組比較，##P<0.01；與左歸丸組比較，&&P<0.01。圖3 ICI182780干預后各組小鼠股骨ERα表達

4 討論

絕經后骨質疏松癥的致病原因主要是雌激素的撤退，在中醫學上認為絕經前后的諸多癥狀及內分泌失衡的病機均為腎虛，故補腎成為了治療的根本所在[7-8]。雌激素作為一種重要的內源性激素，在體內的變化影響著很多生理代謝過程，包括生殖系統、中樞神經系統、心血管系統、免疫系統、骨骼等[9-10]。本研究前部分實驗結果已經證明左歸丸對雌激素剝奪導致的骨損傷具有保護作用[11]。因此為了探究左歸丸對骨質疏松癥的保護作用的機制，本實驗分析左歸丸對雌激素及雌激素受體的影響。

前期研究檢測了左歸丸水煎液對于骨質疏松癥模型小鼠血清中的雌激素水平的影響，采用酶聯免疫吸附法測定了各組小鼠血清中雌二醇的水平，結果證明左歸丸水煎液的各劑量組均不能使卵巢摘除小鼠血清中雌激素水平升高，這說明了左歸丸對骨組織的雌激素樣作用并不是通過增加體內的雌激素水平而實現的[12]。本研究檢測了左歸丸對卵巢摘除小鼠雌激素受體表達的影響，通過免疫組織化學方法測定ERα和ERβ在脛骨近心端骨松質上的表達情況，分析各組平均累計光密度值，結果表明左歸丸對ERα和ERβ的表達均有明顯的影響。同時利用Western blot技術分析了ERα和ERβ在股骨中的表達，統計各電泳條帶的灰度結果，表明左歸丸能夠增加ERα的表達，對ERβ無明顯影響。這個結果預示著左歸丸水煎液對骨組織的作用很可能是通過增加ERα表達實現的。

為了驗證左歸丸對骨質疏松癥模型小鼠的骨保護作用機制是通過增加雌激素受體的表達而實現的，選擇ICI82780進行干預研究。ICI182780，是一種非特異性的雌激素受體阻斷劑，他不同于其他的抗雌激素藥物具有類雌激素樣作用(如他莫昔芬)，所以可以規避很多雌激素過量導致的風險[13]。

據先前研究ICI182780能夠完全阻斷淫羊藿素、去甲基肉毒堿[14]和獐芽菜苷[15]對骨細胞的增殖和分化作用。本研究實驗結果同樣證明，當給小鼠注射ICI182780后再給予左歸丸水煎液進行治療后與左歸丸給藥組比較，小鼠骨組織中的ERα表達降低，小鼠腰椎的骨密度下降，血清中骨代謝相關因子ALP、StrACP和OC升高，即左歸丸對骨的保護作用被阻斷。

總之，本研究的實驗結果表明左歸丸可通過增加小鼠骨骼上ERα的表達而實現調節骨代謝的作用，為臨床上左歸丸治療絕經后骨質疏松癥提供理論支持，也為闡明“腎主骨”理論的研究提供實驗依據。