大黃素對高脂飼料誘導ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響

夏 麗，田維毅*，王和生*，李妹娟，張 磊，賴陳岑

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550000；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550000)

近年來，心血管疾病的發生及死亡呈日益年輕化、增長化趨勢，作為其重要病理基礎，動脈粥樣硬化的預防與治療已成為重點研究對象。作為一種慢性炎癥疾病，從血管內脂質條紋產生到纖維斑塊，再進展為動脈粥樣斑塊，到斑塊不穩定和破裂，炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化發生發展的全過程[1]，始終都能檢測到各種炎癥細胞和炎癥介質，例如巨噬細胞和白細胞介素等炎癥因子。經研究發現，制首烏中的大黃素具有抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、降低血脂的作用[2]。本研究旨在研究大黃素對單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)的影響，為今后防治動脈粥樣硬化提供理論依據。

1 材料

1.1 動物與飼料 雄性SPF級C57BL/6 J小鼠12只，ApoE-/-小鼠60只，6周齡，體質量(20±2)g，購自貴州醫科大學，實驗動物生產許可證號SCXK(黔)2012-0001，實驗操作符合倫理委員會要求。高脂飲食按照21%精煉豬油、0.15%膽固醇、78.85%基礎飼料比例制作[3]。

1.2 藥物、試劑與儀器 大黃素(黃色粉末，純度98.7%，貨號BH20150716，西安飛達生物技術有限公司)；血脂康(批號Z10950029，北京北大維信生物科技有限公司)。小鼠MCP-1 ELISA試劑盒(貨號EMC113)、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒(貨號EMC101)均購自欣博盛生物科技有限公司；脂多糖(貨號L2880，美國Sigma公司)。實時熒光定量PCR儀(型號CFX96)、微電腦PCR儀(型號C1000)均購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 動物模型建立及給藥 將60只成年雄性ApoE-/-小鼠普通飼料喂養1周，隨機分為模型組，大黃素高、中、低劑量組，陽性對照組，每組12只。正常對照組為ApoE-/-小鼠的背景鼠C57BL/6 J成年小鼠，健康雄性，共12只，以基礎飼料常規飼養，灌胃生理鹽水；給藥組小鼠基于高脂飲食，大黃素高、中、低劑量組分別灌胃40、20、10 mg/kg藥物，陽性對照組灌胃200 mg/kg血脂康，連續6周。

2.2 血液、心肌組織采集 給藥6周后隔1 d，小鼠禁食12 h，眼球取血，3 000 r/min離心15 min，分離血清用于生化及ELISA檢測，取小鼠心臟并縱向剪開，得到的心肌組織放入RNA保存液用于提取RNA。

2.3 生化指標檢測 通過全自動酶標儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平。

2.4 RT-qPCR檢測小鼠心肌組織MCP-1、IFN-γmRNA表達 按說明書提取心肌組織RNA，根據試劑盒說明書，冰上配制各組反應液，進行RT-qPCR分析，反應條件為預變性50 ℃，120 s；95 ℃，600 s；熱循環，95 ℃，15 s；退火60 ℃，60 s，40次循環。采用2-△△CT法計算mRNA表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法檢測血清IFN-γ、MCP-1水平 于對照品孔內滴加梯度濃度對照品，樣品孔內滴加待測樣品，37 ℃水浴鍋孵育90 min，洗板5次，甩凈，于空白孔中滴加抗體稀釋液，其余孔中滴加抗體工作液，37 ℃水浴鍋孵育60 min，洗板5次，甩凈，空白孔加酶結合物稀釋液，其余孔加酶結合物工作液，37 ℃水浴鍋孵育30 min，洗板5次，每孔滴加顯色底物液，封板膠覆蓋反應孔，37 ℃水浴鍋孵育15 min，每孔滴加終止液后，置于酶標儀內，檢測吸光度。

3 結果

3.1 各組小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平變化 與正常對照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組和陽性對照組TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.01)，HDL-C水平均升高(P<0.01)，見圖1。

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。圖1 各組小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平

3.2 各組小鼠心肌組織MCP-1、IFN-γ的mRNA表達 與正常對照組比較，模型組MCP-1 mRNA表達升高(P<0.05)，IFN-γmRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組和陽性對照組MCP-1 mRNA表達降低(P<0.01)，IFN-γmRNA表達升高(P<0.05，P<0.01)，見圖2。

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組小鼠心肌組織MCP-1、IFN-γ mRNA表達

3.3 各組小鼠血清MCP-1、IFN-γ水平 與正常對照組比較，模型組MCP-1水平升高(P<0.05)，IFN-γ水平減低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素低、中劑量組和陽性對照組血清MCP-1水平降低(P<0.01)，IFN-γ水平升高(P<0.01)，大黃素高劑量組血清MCP-1、IFN-γ水平均降低(P<0.01)，見圖3。

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。圖3 各組小鼠血清MCP-1、IFN-γ水平

4 討論

動脈粥樣硬化作為心腦血管疾病的病理基礎，主要涉及脂類代謝、炎癥與氧化應激等。上世紀90年代動脈粥樣硬化的炎癥理論提出后[4]，逐漸被世界廣泛接受。血脂與動脈粥樣硬化之間關系已是眾所周知，現在大多數認可，TC、TG、LDL-C的發展誘導動脈粥樣硬化，尤其ox-LDL刺激泡沫細胞生成從而釋放出更多的炎癥介質加重，而HDL-C則是幫助減少其發生發展[5]。MCP-1是巨噬細胞分泌的促炎癥因子，是加速形成動脈粥樣硬化的重要因素之一。臨床研究發現，患有動脈粥樣硬化內膜斑塊的患者，體內血清MCP-1的水平高于正常組[6]。既往研究表明，MCP-1不僅可以趨使單核細胞聚集，加速泡沫細胞形成，還可以對白介素、腫瘤壞死因子等其余促炎癥因子產生影響，促進血管內皮細胞的增殖，加速動脈粥樣硬化斑塊形成[7-8]。IFN-γ曾用名叫巨噬細胞活化因子，為水溶性二聚體，是Ⅱ型干擾素。研究發現，ApoE-/-小鼠建模成功后主動脈壁斑塊免疫組化中可見IFN-γ呈現陽性，表達高于正常組[9]。IFN-γ是雙向調節因子，在動脈粥樣硬化發生發展過程中扮演重要角色。另有學者報道通過調控IFN-γ可以改善動脈粥樣硬化的病變程度[10]，在巨噬細胞中抑制極低密度脂蛋白受體表達，抑制泡沫細胞形成[11]。

大黃素作為制首烏游離蒽醌主要成分，具有抗炎、抗氧化、降低血脂等作用。本課題組前期研究發現，制首烏游離蒽醌抗動脈粥樣硬化作用可能通過上調ABCA1，調控血脂，影響血清NO水平，降低NF-κB、IL-1β表達抑制炎癥反應[12-14]。本研究結果顯示，模型組TC、TG、LDL-C水平較正常對照組升高，提示動脈粥樣硬化模型復制成功；與模型組比較，大黃素各劑量組和陽性對照組TC、TG、LDL-C均有不同程度的下降，提示大黃素可以加速TC、TG、LDL-C的分解，促進血清中HDL-C的合成，起到有良好的調脂作用。從基因表達上看，本研究模型組中MCP-1 mRNA表達升高，IFN-γmRNA表達降低，這與文獻報道一致，進一步說明MCP-1伴隨著動脈粥樣硬化的發展。通過大黃素干預后，MCP-1 mRNA表達降低，IFN-γmRNA表達升高，提示大黃素可以降低MCP-1、升高IFN-γmRNA表達，抑制炎癥反應。ELISA檢測MCP-1水平變化趨勢與基因表達基本一致。大黃素中、低劑量干預后IFN-γ水平升高，而高劑量組表現不同，考慮是大黃素高劑量組在轉錄過程中能升高IFN-γ的表達，但其翻譯修飾等各種因素出現蛋白變化，具體表現差異有待進一步研究。

綜上所述，本研究以ApoE-/-小鼠為對象，炎癥與動脈粥樣硬化的關系為切入點，觀察大黃素對炎癥因子MCP-1、IFN-γ的影響。結果表明，大黃素可以通過調控MCP-1、IFN-γ抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應，具有抗炎及抗動脈粥樣硬化的作用，為臨床防治動脈粥樣硬化及藥物的開發提供了新思路。