蛇床子素對特異性皮炎小鼠皮膚屏障及慢性瘙癢的作用

陳姣蓉，洪小平，段妍君，張彥紅，韓永明

(湖北中醫藥大學基礎醫學院解剖組胚教研室，湖北 武漢 430065)

特異性皮炎(atopic dermatitis，AD)為一種伴隨嚴重瘙癢的炎癥性皮膚病，其具有發病機制多、發病率高、病情易反復等特點。目前認為，遺傳、環境、免疫及皮膚屏障的破壞參與了特異性皮炎的發生機制[1]。臨床治療從改善皮膚屏障和緩解皮膚搔抓次數為主要原則，但目前尚缺乏安全有效的藥物，多采用保濕制劑或抗生素、激素類藥物緩解癥狀[2]。隨著對中藥學研究的深入，發現許多止癢方劑在止癢上有重要價值，其中以蛇床子使用頻率最高，甚至有研究發現蛇床子具有修復皮膚屏障的作用[3]。中醫學中提到，蛇床子內外俱可施治，以外治尤良，具有抗炎、抗病毒、抗過敏等多種作用[4]。蛇床子在心肌梗死[5]、食管鱗癌[6]等多種疾病中參與抗炎、抗細胞凋亡作用，但關于蛇床子在特異性皮炎中是否發揮皮膚屏障保護的作用仍需要更多的研究數據來證實。聚絲蛋白和緊密連接蛋白是皮膚屏障中研究最多的對象，因此本研究通過小鼠實驗來確定蛇床子對AD小鼠模型皮膚屏障和炎癥的改善是否產生積極影響,以期為臨床治療提供新的策略依據。

1 材料

1.1 細胞株 人角質細胞(HaCaT細胞)，由中國醫學科學院細胞庫提供，在含10%胎牛血清AMEM培養基中、在37 ℃、5%CO2的條件下培養。

1.2 動物 無特定病原級的雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質量20～30 g，購自湖北奧菲生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(鄂)2019-0024，動物實驗批準號IACUC20190306，于湖北中醫藥大學實驗動物研究中心完成實驗，實驗環境為溫度(20±2)℃，相對濕度45%～50%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。

1.3 試劑與藥物 噁唑酮液配制方法為將80%丙酮和20%橄欖油混合物作為溶劑，與2%噁唑酮按一定比例混合，分別配制成0.5%、0.2%致敏液，4 ℃避光保存。蛇床子素(純度≥98%，美國Clontech公司)，在4 ℃冰箱中避光保存。p-Akt激動劑SC79(純度98%，上海滬震實業有限公司)，取3.65 mg SC79加入10% DMSO溶液和90%玉米油1 mL配制成10 mmol/L溶液。噁唑酮、橄欖油、丙酮(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，質量分數>50%)；10%胎牛血清、PBS溶液(四川訊麥科技有限公司)；RNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；TaKaRa反轉錄試劑盒、p-Akt一抗、p-Erk一抗(日本TaKaRa公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(上海艾研生物科技有限公司)。

1.4 儀器 實時熒光定量PCR儀(德國Leica公司)；WJ-3-160T型CO2培養箱(上海新諾儀器設備有限公司)；熒光顯微鏡(美國ABI公司)；索尼A7M3高清相機(日本SONY公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 30只小鼠隨機分為空白組、AD組(模型組，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組)，每組6只，實驗前1 d剃毛刀除去背部毛發，確定皮損區域面積約為2 cm×4 cm，適應3 d。第4天，空白組小鼠背部剃毛部位均勻涂抹溶劑150 μL致敏，AD組小鼠均勻涂抹0.5%噁唑酮液150 μL致敏，每組2次。第5天，空白組小鼠取溶劑50、20 μL分別均勻涂抹于背部和右側耳部，AD組小鼠取0.2%噁唑酮液50、20 μL分別均勻涂抹于背部和右側耳部，適應2 d。第7天，空白組小鼠不作其他處理，激動劑組小鼠腹腔注射50 mg/kg p-Akt激動劑SC79，模型組小鼠注射蒸餾水30 mg，蛇床子素低、高劑量組小鼠分別腹腔注射提取物0.3、0.9 mg，此后每48 h注射1次(第11、14天)，最后第21、28天分別刺激1次(空白組小鼠取溶劑50、20 μL，AD組小鼠取0.2%噁唑酮液50、20 μL均勻涂抹于背部和右側耳部)以維持皮損持續存在。第29天進行背部皮損嚴重程度評分，測定搔抓次數，采集血清后處死小鼠，留取皮損組織標本并分為3份，1份置于凍存管中加入一定量的Trizol，完全浸泡皮膚組織，-80 ℃保存，用于RT-qPCR檢測；另外2份常溫保存于10%甲醛中，用于病理及免疫組化檢測。

2.2 皮損評分、搔抓次數測定 肉眼觀察并記錄小鼠背部及耳部皮損癥狀，采用皮損嚴重程度評分進行評價，包括紅斑、滲出、脫屑、苔蘚樣變，0～3分分別表示無皮疹、輕度皮疹、中度皮疹、重度皮疹。實驗結束后，記錄每只小鼠10 min內對自身耳部及背部的搔抓次數，連續搔抓計為1次。

2.3 RT-qPCR法檢測緊密蛋白的mRNA表達 組織中加入1 mL Trizol，吹打混勻后轉入1.5 mL EP管中，漩渦振蕩器充分振蕩，室溫下放置5 min以使細胞充分裂解，加入氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s使其呈乳糜狀，室溫下靜置3 min，分層后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取最上層清亮液體400 μL至1.5 mL DEPC處理過的EP管中，依次加入異丙醇400 μL、75%乙醇1 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，反復吹打使沉淀充分溶解，提取各組細胞總RNA，檢測Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達。

采用Takara反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，以其為模板進行PCR擴增，引物序列見表1，95 ℃預變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循環45次。以GAPDH為內參，按照2-△△CT法計算組細胞中緊密連接蛋白mRNA表達。

表1 引物序列

2.4 Western blot檢測PI3K/Akt通路蛋白表達 組織剪碎，加RIPA裂解液充分裂解后置于組織勻漿器中，10 000 r/min離心5 min，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉至PVDF膜上，選擇濕轉，TBS-T在25 ℃下封閉1 h，加入p-Akt一抗、p-ERK一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，ECL發光試劑盒顯色、顯影，以GAPDH為內參蛋白，通過Image Quant TL軟件分析各條帶的灰度值。

3 結果

3.1 小鼠皮損評分、搔抓次數 模型組小鼠皮損評分、搔抓次數高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組小鼠皮損評分、搔抓次數均降低(P<0.05)，激動劑組小鼠皮損評分、搔抓次數高于蛇床子素低、高劑量組(P<0.05)，蛇床子素低劑量組皮損評分、搔抓次數高于蛇床子素高劑量組(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠皮損評分、搔抓次數比較

3.2 小鼠緊密連接蛋白mRNA表達 與空白組比較，模型組小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達降低(P<0.05)，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達升高(P<0.05)，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表達降低(P<0.05)；蛇床子素低、高劑量組小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達高于激動劑組，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表達低于激動劑組(P<0.05)，見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，▲P<0.05。圖1 各組小鼠緊密連接蛋白mRNA表達

3.3 小鼠PI3K相關蛋白表達 與空白組比較，模型組小鼠p-Akt蛋白條帶信號增強，p-ERK蛋白條帶信號無變化；與模型組比較，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組小鼠p-Akt蛋白條帶信號減弱，見圖2。與空白組比較，模型組小鼠p-Akt表達升高(P<0.05)，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組p-Akt表達低于模型組(P<0.05)，激動劑組p-Akt表達高于蛇床子素低、高劑量組(P<0.05)，蛇床子素低劑量組與蛇床子素高劑量組p-Akt表達差異無統計學意義(P>0.05)，空白組，模型組，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組p-ERK表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

圖2 各組PI3K相關蛋白表達

表3 各組PI3K相關蛋白表達比較

4 討論

近年，聚絲蛋白和緊密蛋白在皮膚屏障中的作用研究較多，緊密蛋白位于皮膚屏障系統的中心位置，為皮膚屏障系統調節的關鍵環節，能夠對刺激做出非常迅速的反應，其功能或水平的改變均可引起皮膚組織缺水、脫水、pH值異常及皮膚屏障功能破壞[7-8]。本研究中表現為皮膚屏障破壞和瘙癢相關癥狀，考慮小鼠缺乏緊密連接蛋白(Cldn、JAM、ZO)后，離子和大分子的細胞外滲透而出現皮膚屏障受損[9]。Cldn-1可影響角質層水屏障功能，參與大分子緊密連接屏障形成。Su等[10]指出，特異性皮炎患者皮膚中緊密連接蛋白Cldn-1、Cldn-6、Cldn-8、Cldn-19、Cldn-23下調，顯著影響了皮膚緊密連接功能。特異性皮炎病灶皮膚汗腺Cldn-1下調，且Nattkemper等[11]證實了Cldn-1可預防汗腺滲漏。ZO-3僅在上皮細胞中表達，參與形成細胞間緊密連接，付莉慧等[12]發現ADF模型小鼠皮膚中ZO-3下調且參與細胞間緊密連接蛋白的形成。Akt信號通路和ERK信號通路與緊密連接蛋白表達相關，為探索AD小鼠模型中參與調節緊密連接蛋白表達的信號通路，取小鼠皮膚樣本對p-Akt和p-ERK表達進行檢測，結果AD模型小鼠皮膚中PI3K/Akt通路中的關鍵蛋白p-Akt上調而p-ERK無顯著變化，提示PI3K/Akt信號通路與特異性皮炎發生相關，參與了人角質形成細胞間緊密連接的形成和AD皮膚平衡的破壞，這與胡雪勤[13]的報道結果一致。同時，激動劑組小鼠p-Akt的變化趨勢與低劑量組、高劑量組一致，p-Akt激動劑可發揮改善緊密連接的作用。激動劑組小鼠抓癢次數和皮損評分較模型組小鼠得到顯著改善，說明Akt信號通路參與調節AD模型小鼠瘙癢癥狀。

蛇床子素治療后小鼠皮損程度和搔抓次數均得到顯著改善，該變化隨著藥物的累積呈漸進式改善，且高劑量組小鼠的改善效果優于低劑量組。蛇床子素作用于小鼠后，其各連接蛋白mRNA表達異常下調，其中以ZO-3下調最明顯；同時，蛇床子素的應用降低了p-Akt表達，且這種作用呈劑量依賴。本研究結果證實了蛇床子素對AD模型小鼠的皮膚屏障和慢性搔抓次數均有顯著影響，其可改善AD小鼠皮膚屏障破壞，這與既往報道結果一致[14-16]。根據Yao等[14]的文獻結果，這與蛇床子素介導了多種炎癥因子有較大關系。孔亮等[15]指出，蛇床子素對開放性腦損傷的小鼠具有一定的治療作用,可能是通過減少炎癥細胞浸潤和細胞凋亡發揮治療作用。李曉婷等[16]報道，蛇床子素可直接作用于而產生抗炎作用。

綜上所述，蛇床子素可通過介導PI3K/Akt通路調控AD小鼠模型皮膚中緊密連接蛋白表達，可改善皮膚屏障受損、減輕慢性搔抓次數，為特異性皮炎治療提供了更有利的臨床依據。