安神定志方對(duì)慢性疲勞綜合征大鼠色氨酸代謝通路及運(yùn)動(dòng)能力的影響

韓 玲，顏志浪，劉長(zhǎng)征

(1.宜春學(xué)院美容醫(yī)學(xué)院，江西 宜春 336000；2.南昌醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一種持續(xù)時(shí)間大于6個(gè)月的體力、腦力疲勞綜合征，近年來(lái)隨著工作、生活壓力增大，發(fā)病率逐步上升，其主要臨床癥狀為極度疲勞、食欲不振、肌肉關(guān)節(jié)痛、發(fā)熱頭痛等，還同時(shí)伴有失眠、抑郁及情緒低落等心理精神癥狀，對(duì)患者的工作和生活造成嚴(yán)重影響[1-2]。氧自由基引發(fā)的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)與慢性疲勞綜合征的發(fā)生密切相關(guān)，炎癥和脂質(zhì)過(guò)氧化可使細(xì)胞內(nèi)酶變性失活，損傷線粒體等細(xì)胞器，促使細(xì)胞衰老、凋亡，造成機(jī)體組織器官功能低下，產(chǎn)生疲勞感[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性疲勞綜合征的發(fā)生還與色氨酸代謝異常引起的5-HT系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)，5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可提高大腦對(duì)疲勞信號(hào)的敏感性，高水平5-HT可影響睡眠，使機(jī)體產(chǎn)生疲倦感，5-HT是色氨酸的代謝產(chǎn)物，因而色氨酸代謝水平可影響慢性疲勞綜合征的發(fā)生發(fā)展[5]。安神定志方由遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯神、茯苓、龍齒、黨參組成，具有健脾益氣、鎮(zhèn)驚安神、健脾寧心的功效，可降低炎癥因子水平，抑制炎癥反應(yīng)，減輕阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)元損傷，修復(fù)大腦學(xué)習(xí)、記憶功能，還對(duì)抑郁癥、焦慮癥、原發(fā)性失眠具有較好的療效[6-9]，因而推測(cè)安神定志方可能對(duì)慢性疲勞綜合征具有一定的療效，本文通過(guò)建立CFS模型大鼠，探討其對(duì)CFS大鼠色氨酸代謝通路及運(yùn)動(dòng)能力的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自廣東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0034，在宜春學(xué)院美容醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，維持室內(nèi)溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，整體環(huán)境清潔安靜，通風(fēng)良好，自然光照，定期更換墊料，保證飼料、飲水充足。

1.2 藥物、試劑及儀器 安神定志方由遠(yuǎn)志5 g、石菖蒲5 g、茯神15 g、茯苓15 g、龍齒25 g、黨參15 g組成[北京同仁堂(集團(tuán))有限公司]；蓯蓉益腎顆粒(2 g/袋，內(nèi)蒙古蘭太藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030099)。大鼠色氨酸ELISA試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司，貨號(hào)LCS34609)；SOD檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒及大鼠IL-6、5-HT、TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A001-3-2、A003-1-2、H007、H104、H052)。SA215曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、SA210懸尾實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)；XR-XC105型Morris水迷宮系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；XPN-100低溫高速離心機(jī)[貝克曼庫(kù)爾特生物科技(蘇州)有限公司]。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥 采取慢性束縛和冷水力竭游泳相結(jié)合的方法制備模型[10]，將大鼠放入一個(gè)長(zhǎng)18 cm、直徑7 cm、前端有內(nèi)徑為1.5 cm的漏斗樣通氣口的圓柱形塑料筒中，進(jìn)行束縛來(lái)限制其活動(dòng)，每天30 min，然后放入內(nèi)壁光滑的游泳箱內(nèi)游泳至力竭，以頭部沉入水中3 s不能回到水面或游泳動(dòng)為無(wú)力失調(diào)，水深約45 cm，水溫18～22 ℃，每天1次，持續(xù)2周，當(dāng)大鼠體質(zhì)量明顯減輕、毛發(fā)稀疏泛黃、背部皮膚松弛、大便干結(jié)或稀溏，表現(xiàn)出精神萎靡、四肢蜷臥、飲食減少等疲勞癥狀時(shí)，可認(rèn)為模型構(gòu)建成功，共建模63只，取其中成功得60只隨機(jī)分為模型組，安神定志方低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg)，蓯蓉益腎顆粒(417 mg/kg)組，每組12只，另取12只SD大鼠作為對(duì)照組。

將1劑安神定志方[7](生藥80 g)加800 mL水浸泡12 h，煎煮后過(guò)濾3次，合并濾液，濃縮至1 000 mL，生藥量為80 mg/mL，生理鹽水稀釋至5、10、20 mg/mL；蓯蓉益腎顆粒[11]以生理鹽水溶解，得到41.7 mg/mL藥液，灌胃劑量均為10 mL/kg，模型組、對(duì)照組灌胃給予等劑量生理鹽水，每天1次，持續(xù)21 d。

2.2 大鼠運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)

2.2.1 鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn) 尼龍繩一端捆綁在大鼠尾端1 cm處，另一端固定在橫桿上，使其頭朝下呈倒掛狀態(tài)，頭部距地面1 m左右時(shí)會(huì)掙扎，一段時(shí)間后因體力和心理變化，會(huì)間隔性地出現(xiàn)靜止不動(dòng)狀態(tài)，記錄5 min內(nèi)靜止不動(dòng)時(shí)間[12]。

2.2.2 冷水竭力游泳實(shí)驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法，測(cè)定大鼠游泳至力竭所用時(shí)間。

2.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將大鼠置于空地上自由活動(dòng)，空地有20個(gè)大小一致的方格，觀察并記錄大鼠在3 min內(nèi)穿越方格的格數(shù)(以三爪及三爪以上均進(jìn)入同一方格為準(zhǔn))[13]。

2.2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 將水池(直徑160 cm、高50 cm)平分為4個(gè)象限，于正中固定4個(gè)不同標(biāo)記，作為第一、二、三、四象限參照，向水池加水，使水深為22 cm，水溫約25 ℃，在第三象限正中放置1個(gè)平臺(tái)，直徑12 cm、高20 cm，大鼠在水池中做適應(yīng)訓(xùn)練5 d，第6天開始實(shí)驗(yàn)，將大鼠依次從第一至第四象限面朝池壁的標(biāo)記放入水中，記錄找到水下平臺(tái)的時(shí)間，即為平均逃避潛伏期；撤去平臺(tái)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在1 min內(nèi)穿越平臺(tái)原位置的次數(shù)[14]。

2.3 標(biāo)本收集 運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠尾靜脈取血5 mL，靜置15 min后4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，血清在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ颐崖樽泶笫蠛螅瑪囝^處死，剪取0.5 g腦組織，加入1 mL裂解液，制備為勻漿液，在4 ℃、3 000 r/min下離心20 min，收集上清，在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 大鼠血清色氨酸、TNF-α、IL-6水平及腦組織5-HT水平檢測(cè) 取出“2.3”項(xiàng)下大鼠血清及腦組織樣品液，置于冰水浴中緩慢解凍，采用ELISA法分別檢測(cè)血清色氨酸、TNF-α、IL-6水平和腦組織中5-HT水平，操作步驟參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5 大鼠血清MDA水平、SOD活性檢測(cè) 取出“2.3”項(xiàng)下血清，置于冰水浴中緩慢解凍，參照各自試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清MDA水平、SOD活性。

3 結(jié)果

3.1 鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間縮短(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間比較

3.2 冷水竭力游泳實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠游泳時(shí)間縮短(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠游泳時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠游泳時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠游泳時(shí)間比較

3.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠跨格數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠跨格數(shù)升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠跨格數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠跨格數(shù)比較

3.4 水迷宮實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中穿越原平臺(tái)位置次數(shù)降低(P<0.05)，平均逃避潛伏期升高(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中穿越原平臺(tái)位置次數(shù)升高(P<0.05)，平均逃避潛伏期降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中穿越原平臺(tái)位置次數(shù)和平均逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠平均逃避潛伏期及穿越原平臺(tái)位置次數(shù)比較

3.5 大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平升高(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平比較

3.6 大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠血清MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠血清MDA水平、SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表6 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

3.7 大鼠血清TNF-α、IL-6水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠血清TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表7。

表7 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

4 討論

慢性疲勞綜合征屬于亞健康性疾病，又稱為肌痛性腦脊髓炎，是一種以反復(fù)持續(xù)發(fā)作的極度疲勞為主要臨床表現(xiàn)的全身性綜合征，除了肌肉關(guān)節(jié)痛、頭痛、食量減少、淋巴結(jié)腫大、反復(fù)性上呼吸道感染等軀體癥狀外，還伴有焦慮、抑郁、認(rèn)知功能下降等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，且與一般性疲勞不同，充分的休息并不能緩解CFS患者的癥狀[1-2,15]。本文采用慢性束縛和冷水力竭游泳相結(jié)合的方法制備CFS大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建模大鼠體重明顯變輕、毛發(fā)稀疏泛黃、背部皮膚松弛、大便干結(jié)或稀溏，表現(xiàn)出精神萎靡、四肢蜷臥、飲食減少等疲勞癥狀；以鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)、冷水竭力游泳實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)行為能力。結(jié)果顯示，大鼠鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)中靜止不動(dòng)時(shí)間、水迷宮實(shí)驗(yàn)中平均逃避潛伏期升高，冷水竭力游泳實(shí)驗(yàn)中游泳時(shí)間、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中跨格數(shù)、水迷宮實(shí)驗(yàn)中穿越原平臺(tái)位置次數(shù)降低，表明大鼠經(jīng)慢性束縛和冷水力竭游泳處理后，學(xué)習(xí)記憶和運(yùn)動(dòng)能力減弱，表現(xiàn)出焦慮、精神萎靡、四肢倦怠等疲勞癥狀，揭示模型建立成功。

慢性疲勞綜合征在臨床中沒(méi)有明顯的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的異常，給西醫(yī)的治療帶來(lái)了困難，目前主要是針對(duì)抑郁、焦慮或失眠等的對(duì)癥治療，效果并不理想，因而中醫(yī)藥在CFS的治療中得到了廣泛的應(yīng)用[10-11]。中醫(yī)認(rèn)為慢性疲勞綜合征屬于“虛勞”“郁證”“內(nèi)傷發(fā)熱”等范疇，病位在肝、脾、腎，多慮、勞作過(guò)度或外邪侵襲致肝、脾、腎受損，致肝失疏泄、脾失運(yùn)化、腎氣不充，進(jìn)而導(dǎo)致氣血不足、陰陽(yáng)兩虛，從而引發(fā)懈怠安臥、腦轉(zhuǎn)耳鳴、脛酸眩冒[16]。安神定志方出自清代《醫(yī)學(xué)心悟》，主要成分為遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯神、茯苓、龍齒、黨參。石菖蒲和遠(yuǎn)志鎮(zhèn)驚安神、行氣解郁、除痰活血，龍齒、茯神定驚鎮(zhèn)心、寧心健脾，茯苓、黨參健脾和胃、利水滲濕、補(bǔ)中益氣，全方共湊健脾解郁、調(diào)理氣血、化痰行氣、安神利眠的功效，安神定志方還可抑制促炎因子表達(dá)，阻止炎癥發(fā)生發(fā)展，減輕阿爾茨海默病造成的神經(jīng)元損傷，提高大腦學(xué)習(xí)記憶能力，改善焦慮、抑郁及失眠癥狀[6-9]，因而推測(cè)安神定志方可能用于治療慢性疲勞綜合征。本文結(jié)果顯示，以不同劑量安神定志方處理CFS模型大鼠，可降低其靜止不動(dòng)時(shí)間、平均逃避潛伏期，升高游泳時(shí)間、跨格數(shù)、穿越原平臺(tái)位置次數(shù)，并呈劑量依賴性，表明安神定志方可提高CFS大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，改善其焦慮及疲勞癥狀，并修復(fù)其運(yùn)動(dòng)功能，且隨劑量升高而作用增強(qiáng)。

慢性疲勞綜合征的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激水平增加、細(xì)胞免疫功能異常、神經(jīng)炎癥是重要的致病因素，高水平的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致外周組織細(xì)胞，特別是骨骼肌細(xì)胞的胞膜及DNA損傷，從而損傷患者運(yùn)動(dòng)功能，細(xì)胞免疫功能異常及凋亡脫落的細(xì)胞碎片可激活巨噬細(xì)胞，引發(fā)腦部炎癥反應(yīng)，促使神經(jīng)元凋亡，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，以色氨酸為起始的5-HT系統(tǒng)功能紊亂是慢性疲勞綜合征的發(fā)病機(jī)制之一，慢性疲勞綜合征患者血中色氨酸水平明顯高于健康人群，分析認(rèn)為，疲勞狀態(tài)下，機(jī)體脂肪動(dòng)員增強(qiáng)，造成血中色氨酸水平升高，進(jìn)入大腦代謝，在5-HT能神經(jīng)元內(nèi)合成5-HT，增加腦內(nèi)5-HT水平，最終引起5-HT系統(tǒng)功能紊亂[5,20]。本文結(jié)果顯示，CFS模型大鼠經(jīng)不同劑量安神定志方處理后，其血清色氨酸、MDA、TNF-α、IL-6水平及腦組織5-HT水平降低，血清SOD活性升高，并呈劑量依賴性，表明安神定志方可降低CFS大鼠氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥，減弱色氨酸代謝過(guò)程，改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能，減輕其疲勞癥狀。

綜上所述，安神定志方可減弱氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，降低色氨酸代謝水平，修復(fù)CFS大鼠運(yùn)動(dòng)功能，改善其疲勞癥狀，為慢性疲勞綜合征的臨床治療提供了新的參考。但本文僅對(duì)表面現(xiàn)象進(jìn)行了初步研究，安神定志方具體是通過(guò)哪些信號(hào)通路起作用的，還未涉及，有待后續(xù)深入研究其分子機(jī)制。