甘草及姜根提取物復配乳液舒緩功效研究

薛文斌 盧正君 董長青

目的：研究甘草酸二鉀和姜黃素復配乳液的舒緩功效。

方法：MTT法檢測復配乳液對小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞毒性;選擇無毒性濃度構建LPS刺激模型，酶聯免疫法（ELISA）檢測培養上清中炎癥因子TNF-α的含量。初步人體實驗隨機選取6名敏感皮膚志愿者，臉部使用復配乳液4周，4周后檢測水分含量、經皮水分流失的變化并拍照觀察。

結果：復配乳液a及b在0.556毫克/毫升濃度范圍內對細胞無毒性;RAW264.7細胞在給予LPS 刺激后，TNF-α含量顯著升高（P<0.01）;復配乳液a 在0.55毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升濃度下能顯著抑制LPS 誘導下TNF-α 的生成（P<0.01和P<0.05）;復配乳液b 在0.185 毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升濃度下能顯著抑制LPS 誘導下TNF-α的生成（P<0.05和P<0.01）。初步人體實驗顯示，使用復配乳液a、b4周后，臉部水分含量顯著增加（P<0.01），經皮水分流失顯著減少（P<0.01）。

結論：甘草酸二鉀和姜黃素復配乳液a及b可抑制TNF-α的生成，具有一定舒緩功效。

舒緩，一般是指能夠緩解皮膚泛紅、發熱、刺痛等現象的能力。這些問題通常由外界刺激引起，一般都會伴有炎癥的產生。近年來，開發具有舒緩功效的化妝品成為各化妝品公司的研究熱點，化妝品原料中純天然植物提取物又以其安全無毒、溫和無刺激及較強的舒緩能力而備受青睞。甘草是一種傳統的舒緩草本植物，甘草具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎和免疫調節特性。甘草次酸和甘草酸是從甘草中分離得到的特殊化合物。甘草酸二鉀是甘草酸二鉀鹽，是一種應用廣泛的抗炎劑。Lee等發現甘草酸二鉀具有改善特應性皮炎的作用。姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種多酚類化合物，具有良好的抗炎特性，研究發現姜黃素能顯著抑制巨噬細胞炎癥因子含量及其基因表達。脂多糖（lipopolysaccharide） 是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是臨床革蘭陰性細菌引發敗血癥的主要原因。脂多糖活化的小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，被廣泛用于研究炎癥反應。巨噬細胞在脂多糖的刺激下，可誘導TNF-α、IL-1等多種炎癥因子迅速合成與釋放。本研究將甘草酸二鉀和姜黃素進行復配，配合水、油脂、乳化劑、流變調節劑等制備成兩種化妝品乳液，通過構建LPS 誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥模型及初步人體實驗來評價兩種復配乳液的舒緩功效。

Part 1實驗材料

1.1 細胞株與試劑

小鼠巨噬細胞RAW264.7購自廣東博溪生物科技有限公司;DMEM 高糖培養基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自Gibco;臺盼藍購自Thermo;LPS購自Sigma;MTT 購自Biosharp;二甲基亞砜（DMSO）購自Admas-Beta;小鼠TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司;甘草酸二鉀購自甘肅泛植制藥有限公司;姜黃素購自韓國NFC;乳化劑甘油硬脂酸酯檸購自Symrise;EMT-10 購自SEPPIC S.A;PEG-10 聚二甲基硅氧烷購自Shin-Etsu Silicones （Thailand） Limited;二硬脂二甲銨鋰蒙脫石購自海名斯英國有限公司。

1.2 受試樣品

甘草酸二鉀、姜黃素復配乳液由本公司內部復配，輔以水、油脂、乳化劑、流變調節劑等復配成乳液a及乳液b兩種乳液。配方詳見表1。

1.3 儀器設備

CO培養箱（上海博迅，BC-J160）;生物安全柜（上海尚道，BHC-1300IIA2）; 酶標儀（TECAN，InfiniteF50）;離心機（湖南湘儀，H1850R）;細胞計數儀（Thermo，Countess Ⅲ）; 倒置顯微鏡（奧林巴斯，CKX53）;水浴鍋（ 江陰市保利科研器械有限公司，BHS-4）;Cutometer? dual MPA 580（德國Courage+khazaka）;便攜式經皮水分流失儀（Delfin）;Antera 3D（Delfin）。

Part 2?實驗方法

2.1 樣品處理

細胞實驗：復配乳液a 和復配乳液b 分別稱取0.5克，用蒸餾水定容到總體積為5 毫升，制成濃度為100 毫克/毫升的水溶液。給藥時將此水溶液200微升加入到3.8毫升高糖DMEM（含10% 胎牛血清）中，20微米過濾膜過濾除菌，制成含復配乳液濃度為5毫克/毫升的培養基溶液，再以3倍稀釋，分別制成含復配乳液濃度為1.667毫克/ 毫升、0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升、0.021毫克/毫升的培養基溶液。以上樣品現配現用。初步人體實驗直接將復配乳液涂抹于臉部。

2.2 細胞培養及傳代

小鼠巨噬細胞RAW264.7 以每瓶8.0×106個細胞接種于T75培養瓶中、高糖DMEM（含10% 胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗）、37攝氏度，5% CO培養箱培養，

每天換液。待細胞融合率為80% ～ 90% 時進行傳代，用細胞刮刀將細胞刮下，離心吹打混勻傳代培養，以每瓶8.0×106 個細胞接種于T75 培養瓶中，2 天傳一次代。

2.3 實驗分組

細胞毒性檢測設置空白對照、陰性對照、樣品及陽性對照;LPS 刺激模型檢測設置空白對照、陰性對照（NC）、樣品及陽性對照（PC）。

2.4 細胞毒性檢測

小鼠巨噬細胞RAW264.7培養后，用細胞刮刀將細胞刮下，離心吹打混勻，計數，按每100微升/ 孔含3.0×104個細胞鋪于96 孔板中，37 攝氏度，5% CO培養箱培養24小時。24小時后小心吸棄每孔培養基，加入不同濃度的待測物，每個濃度3 個復孔，繼續放入37 攝氏度，5%CO培養箱培養20小時。20小時后每孔加入5毫克/ 毫升的MTT 溶液，繼續放入37℃，5% CO培養箱培養4小時。4小時后小心吸棄每孔上清，加入150微升/ 孔的DMSO吹打至充分混勻，室溫避光放置30 分鐘。用槍將細胞懸液再次吸打混勻，在酶聯免疫檢測儀OD492 納米處測量各孔的吸光值（OD值）。

2.5 細胞毒性計算 ）

細胞相對活率（%）=（樣本OD-空白OD）/（ 陰性對照OD-空白OD）×100%

2.6 脂多糖（LPS）刺激RAW264.7炎癥模型檢測

小鼠巨噬細胞RAW264.7培養后，用細胞刮刀將細胞刮下，離心吹打混勻，計數，按每100微升/孔含3.0×104個細胞鋪于96孔板中，37攝氏度，5% CO培養箱培養24小時。24小時后小心吸棄培養基，按照MTT 毒性結果，加入含復配乳液安全濃度的培養基溶液，37攝氏度，5% CO培養箱預處理2小時。空白對照、陰性對照加入正常培養基;陽性對照加入100微克/ 毫升的地塞米松，同樣37 攝氏度，5% CO2培養箱預處理2小時。2小時預處理結束后，除空白對照孔外，每孔加入終濃度為10微克/毫升的LPS進行刺激，37攝氏度，5% CO培養箱繼續培養24 小時。24小時孵育培養結束后，每孔收集200微升細胞培養上清液于1.5毫升無菌離心管中，置于-80攝氏度超低溫冰箱冷凍保存備用。按照ELISA 檢測試劑盒說明進行TNF-α含量檢測。

2.7初步人體實驗

隨機選取6 名敏感皮膚志愿者，臉部使用復配乳液四周，檢測6 名志愿者使用前及使用4 周后臉部水分含量、經皮水分流失的變化，并進行拍照觀察。

2.8統計分析

所有實驗數據以x±s表示，應用SPSS 21.0進行統計分析，采用t 檢驗分析方法，以P<0.05為顯著性差異的標準。

Part 3實驗結果

3.1 復配乳液對小鼠巨噬細胞RAW264.7 毒性檢測MTT 結果顯示，以相對活率90% 以上為無毒性標準，復配乳液a 和復配乳液b 在0.556 毫克/ 毫升濃度及此濃度以下對小鼠巨噬細胞RAW264.7 均無毒性，可選取為LPS 刺激炎癥模型的實驗濃度，具體見表2，細胞相對活率如圖1所示。

3.2 復配乳液對LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7產生TNF-α的影響

根據毒性測試結果，選擇復配乳液a（0.556毫克/毫升、0.185毫克/毫升、0.062毫克/ 毫升）及b（0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升）3個無毒性濃度分別進行實驗，結果顯示小鼠巨噬細胞RAW264.7在LPS 的誘導下TNF-α含量顯著上升（P<0.01）;復配乳液a（0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升）能顯著抑制LPS誘導下TNF-α的生成（P<0.01 和P<0.05）;復配乳液b（0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升）能顯著抑制LPS誘導下TNF-α的生成（P<0.05 和P<0.01）;同濃度復配乳液a 和b相比，0.556毫克/ 毫升、0.185毫克/毫升無顯著差異，0.062毫克/ 毫升具有極顯著差異（P<0.01）。具體見表3，TNF-α含量趨勢如圖2所示。

3.3 初步人體實驗結果

結果顯示在使用復配乳液a、b4周后，與不使用產品的臉部對比水分含量顯著增加（P<0.01）;經皮水分流失顯著下降（P<0.01）;臉部拍照顯示血紅素含量顯著下降。具體見表4，如圖3 所示，臉部拍照結果如圖4所示。

Part 4結論

近年來，化妝品舒緩功效的研究越來越得到人們的重視，舒緩原料是舒緩功效的核心，而原料不能直接作用于人體，將原料進行復配，制成化妝水、乳或霜是通用的方法，但當多種原料及輔料共同混合后，原料含量降低，且原料之間可能存在互相影響，舒緩原料是否能發揮其原來的舒緩功效需要進行驗證。

本研究通過構建LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型結合初步人體實驗來評價甘草酸二鉀、姜黃素復配乳液a、b的舒緩功效。實驗結果顯示，復配乳液a、b均能夠顯著抑制炎癥因子TNF-α的生成。初步人體實驗結果亦顯示其作用于人體皮膚具有一定的舒緩功效。

作者介紹：

薛文斌、盧正君、董長青：上海宜儂生物科技有限公司研發中心