豬捷申病毒實驗室診斷方法綜述

李同斌，張玉良，李錫峰

摘要：豬捷申病毒是引起豬多種癥狀甚至死亡的重要病毒性傳染病之一，嚴重危害養豬業健康發展。正確診斷豬捷申病毒病對防治該病極為關鍵。本文就該病病原分離鑒定、血清學診斷、分子生物學診斷三方面展開闡述，以期弄清該病診斷方面的研究進展。

關鍵詞：豬捷申病毒;診斷方法;綜述

豬捷申病（porcine teschen disease）是由豬捷申病毒（porcine tescho virus，PTV）引起豬中樞神經系統受侵害而導致一系列神經癥狀的傳染病，以感覺過敏、震顫、麻痹、癱瘓和驚厥等為特征[1-3]。1929年在原捷克斯洛伐克捷申地區首次報道，所以又稱之為捷申病。此后歐洲、澳大利亞、北美、亞洲和非洲等均有本病的報道。2003年中國農科院哈爾濱獸醫研究所首次分離到豬捷申病毒血清1型。到目前為止，豬捷申病已陸續在黑龍江、山東、北京、河南、云南、上海等省市檢測出，這說明豬捷申病已經在我國蔓延開來，嚴重影響了我國的生豬生產，給我國的養豬業造成了較大的損失。

防治該病的關鍵措施之一是對該病病原的確診。由于當前豬病復雜，混合感染現象嚴重且本病血清型眾多，因此通過傳統診斷方法進行本病的確診已不現實，并且隨著生豬生產不斷向規模化、工廠化方向發展，生豬養殖密度不斷提高，導致生豬疾病診斷準確性和及時性要求不斷增加，因此豬捷申病診斷必須依靠實驗室來診斷。自豬捷申病發現以來，很多專家學者對該病的實驗室診斷方法進行了各種方式的探索和研究，成功獲得了該病的實驗室診斷方法，具體如下。

1 豬捷申病毒分離鑒定

采集樣品（發病急性期的早期采集喉拭子和腦脊髓液有利于病毒的分離;對于疑似病例，可用糞便樣品進行病毒的分離）;將樣品用勻漿器研磨制成懸液，反復凍融、離心取上清，并用0.22μm過濾除菌;接種于豬的胚胎、腎、腸或PK-15單層細胞，培養3～6d，觀察細胞病變。初代培養病毒滴度往往較低，細胞病變不明顯或熒光信號不典型，不易判定，最好盲傳幾代再觀察病變或做熒光染色鑒定。病毒分離耗時長、步驟繁瑣、對操作人員技術要求高，僅在實驗室使用。

2 血清學診斷

該方法主要是通過檢測捷申病毒特異性抗體，來診斷病豬是否患有豬捷申病。血清學診斷方法主要包括：病毒中和試驗、間接免疫熒光試驗和酶聯免疫吸附試驗。

病毒中和試驗：先將血清56℃滅活30min;用細胞培養液倍比稀釋血清，添加100TCID50/孔病毒，37℃孵育1h;繼續添加豬腎細胞懸液，置37℃ CO2培養箱中培養;計算血清中和效價。

間接免疫熒光試驗：王瑤等[4]首先構建PTV VP1表達系統，然后利用該系統建立了檢測PTV血清抗體的間接免疫熒光方法;利用該方法對哈爾濱周邊地區的575份豬血清樣品進行檢測，PTV感染的陽性率為60.17%。2011年，劉芹防等[5]用全病毒（PTV-8 Jilin/2003株）制備抗原板，以鼠抗豬IgG熒光標記抗體為二抗，建立了檢測PTV抗體的間接免疫熒光技術方法，該方法與病毒中和試驗方法符合率為94.0%，用該方法檢測1，500份臨床血清樣品，平均陽性率為55.8%。

酶聯免疫吸附試驗：胡峰等[6]以原核表達純化的PTV VP1重組蛋白為包被原，建立起豬捷申病毒抗體的間接ELISA檢測方法;并運用ELISA檢測方法對633份臨床樣品進行檢測，陽性率是88.10%;選取58份臨床樣品與間接免疫熒光方法作比對試驗，兩者的符合率是94.80%。酶聯免疫吸附試驗相對來說比較容易操作，并且對于試驗條件和人員的要求都不高，一次能夠檢測大批量的樣本，非常適合養殖場診斷疫病和縣級及以下的實驗室做流行病學調查。

3 分子生物學檢測

豬捷申病毒分子生物學檢測方法是基于檢測PTV病毒核酸序列發展起來的，豬捷申病毒分子生物學檢測方法主要包括RT-PCR以及熒光定量RT-PCR兩種方法。豬捷申病毒分子生物學檢測方法是診斷豬捷申病最為準確、速度最快還可以一次對大批量樣本進行檢測的方法，并且該檢測技術在檢測豬是否感染豬捷申病毒的同時還能檢測豬瘟、藍耳病和圓環病毒，不受其他病毒的干擾，一次檢測3～4h就可以全部完成。

RT-PCR，其主要利用的是聚合酶鏈式反應。就是在RT-PCR中，首先將一條RNA鏈逆轉錄成為互補的DNA，然后以此DNA為模板，利用PCR進行DNA的擴增。趙國洪等[7]根據Gen Bank收錄的PTV基因序列設計套式引物，建立了檢測PTV的套式RT-PCR診斷方法，應用該方法能夠從云南省某豬場疑似豬捷申病的病料中檢測出PTV核酸陽性;張曉杰等[8]根據Gen Bank登錄有關的豬捷申病毒基因序列，并選擇保守區域進行引物的設計，應用該方法對43份臨床樣品進行檢測發現，PTV陽性率為23%。

熒光定量RT-PCR檢測法，是通過運用PCR擴增反應對每一個循環產物進行熒光信號的實時檢測，通過這種方法來實現對起始模板定量及定性的分析。該檢測方法廣泛應用于分子生物學、基因學以及臨床醫學領域。王建峰等[9]通過設計引物和TaqMan探針，建立起豬捷申病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，用該方法檢測來自豬場的156份豬糞便樣品，陽性檢出率為38.5%，與套式RT-PCR符合率達100%;胡峰等[10]于2012年建立了檢測PTV的TaqMan實時定量RT-PCR方法（基于PTV基因組5'端非編碼區保守序列設計引物和TaqMan探針），應用該方法和病毒分離方法分別檢測了91份臨床樣品，檢出率分別為79.12%和57.14%，兩者的符合率是78.02%;楊濤濤等[11]2019年建立一種檢測豬捷申病毒（PTV）的SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR方法，該方法特異性強（對除PTV外的其他常見豬病毒性病原的DNA或cDNA均無特異性的擴增），該方法的敏感性高、重復性好，靈敏度能達到38.3copies/μL（對臨床樣品的檢測熒光定量RT-PCR方法的PTV檢出率為68.18%，遠高于普通RT-PCR的PTV檢出率（22.73%））;秦毅斌等[12]于2020年建立豬捷申病毒（PTV）的TaqMan實時熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）檢測方法，該方法僅對PTV出現特異性擴增反應，與豬流行性腹瀉病毒、豬丁型冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、A群豬輪狀病毒等常見豬病毒均無交叉反應，應用所建立的方法對235份臨床豬腹瀉樣品進行檢測，PTV陽性樣品32份，樣品陽性率為13.62%。

4 展望

目前在我國對豬捷申病毒研究較少，尤其是在疫苗方面，至今還未研制。我國是世界上生豬養殖第一大國，豬肉是全國人民最主要的肉食來源，是主要蛋白質的提供者。2018年我國因暴發非洲豬瘟，導致生豬存欄量驟降，豬肉價格創國內歷史新高，嚴重影響普通群眾的生活。經過近3年的恢復，生豬存欄才恢復到非洲豬瘟暴發前的90%以上。因此，為了保證我國人民群眾的食品安全，我國畜牧獸醫等相關部門，必須要做到未雨綢繆，加大對豬捷申病毒的研究力度，盡快研制出相關疫苗，防止豬捷申病在我國出現大范圍流行。

參考文獻：

[1] 李廣德.豬捷申病的流行、診斷與防治[J].現代畜牧科技，2016（3）：105.

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[7] 趙國洪，嚴歡，韓建強，等.云南豬群中豬捷申病毒感染分子生物學診斷[J].養豬，2017（2）：113-115.

[8] 張曉杰，劉業兵，湯德元，等.豬捷申病毒與豬圓環病毒2型雙重PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國獸藥雜志，2012（4）：10-13.

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[10] 胡峰，趙亞榮，呂超超，等.豬捷申病毒TaqMan實時定量RT-PCR方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2012（3）：206-210.

[11] 楊濤濤，張凌倩，謝明旺，等.豬捷申病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR方法的建立[J].中國獸醫科學，2019，49（5）：639-643.

[12] 秦毅斌，蘇乾蓮，趙碩，等.豬捷申病毒TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立和初步應用[J].中國獸醫雜志，2020，56（11）：37-42+46.