高效液相色譜法測定雙葛止瀉口服液中葛根素的含量

朱華偉，周冰，李煥娟,李傳棟，張聰，周德剛

摘要：本試驗旨在建立雙葛止瀉口服液中葛根素的含量測定方法。試驗用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm），以甲醇-0.4%磷酸溶液（24∶76）為流動相;檢測波長為250nm;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃。結果表明，葛根素進樣量在0.1616～1.6159μg的范圍內線性關系良好（r=0.9999），回收率的平均值為100.5%，RSD為0.8%。因此，該方法準確度高、專屬性好，可用于雙葛止瀉口服液中葛根素的質量控制。

關鍵詞：雙葛止瀉口服液 ;葛根素;高效液相色譜法

雙葛止瀉口服液是由金銀花、葛根、黃芩、黃連等中藥組成，采用提取、純化技術，加入適宜的輔料，滅菌而制成的口服液制劑。本方來源于《傷寒論》中的經典方劑“葛根芩連湯”，通過組方加減，工藝優化而制成的新型中獸藥制劑，為農業農村部批準的國家三類新獸藥（農業農村部公告 第186號）。本方具有清熱燥濕，解毒止瀉的功效，用于仔豬濕熱泄瀉。方中金銀花清熱解毒、疏散風熱，葛根解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經活絡，二者共為君藥。研究表明，本品具有一定的抗炎止瀉作用，其止瀉機制與抑制胃腸運動具有相關性[1]，且本品對麻雞大腸桿菌病具有良好的治療效果[2]。方中金銀花的化學成分主要為黃酮類、環烯醚萜類、三萜及三萜皂苷類和有機酸類等[3]，葛根的化學成分主要為葛根素、大豆苷元和大豆苷等異黃酮類化合物，香豆素類及三萜及三萜皂苷類成分，此外還有豐富的礦物質和氨基酸[4]。公司已建立該產品中指標成分綠原酸的含量測定方法[5]，為了更好地控制該產品的質量，本文采用高效液相色譜法，建立了本品中葛根素的含量測定方法，并對該方法進行了系統的方法學研究，以期為該制劑的質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀（配2489型紫外檢測器，美國Waters公司）;AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.1.2 試藥與試劑 葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-201514，含量：95.5%）;雙葛止瀉口服液（洛陽惠中獸藥有限公司，批號：20170201，20170202，20170203，規格：0.45g生藥/mL）;乙腈（HPLC級，Thermo Fisher Scientific公司）;磷酸（HPLC級，天津市科密歐化學試劑有限公司）;水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm）。流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（24∶76），流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：250nm;進樣量：10μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成每1mL含80μg的溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品2mL，置100mL量瓶中，加10%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方制備缺葛根的陰性對照樣品，按“.2.3”項下方法制成陰性對照溶液，即得。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1專屬性。分別取“1.2.2”項下對照品溶液、“1.2.3”項下供試品溶液及“1.2.4”項下陰性對照溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按上述“1.2.1”項下的色譜條件，依法測定并記錄色譜圖。

1.2.5.2線性關系。取“1.2.2”項下對照品溶液，分別精密吸取2、5、10、15和20μL注入高效液相色譜儀，按上述“1.2.1”項下的色譜條件依法測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，葛根素的進樣量（X，μg）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數。

1.2.5.3精密度。取“1.2.2”項下對照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件依法測定，連續進樣6針，測定峰面積并計算RSD。

1.2.5.4重復性。取雙葛止瀉口服液樣品（批號：20170201），平行6份，分別按照“1.2.3”項下的操作方法制備供試品溶液，并按上述“1.2.1”項下的色譜條件依法測定，記錄峰面積并計算葛根素含量及RSD。

1.2.5.5溶液穩定性。取雙葛止瀉口服液（批號：20170201），按照"1.2.3"項下方法制備供試品溶液，分別于第0、2、4、8和12h進樣，依法測定，記錄峰面積并計算峰面積的RSD。

1.2.5.6加樣回收率。精密稱取葛根素對照品35.22mg，置25mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密吸取已知含量的樣品（批號：20170201，含量：4.0mg/mL）6份，每份1mL，置100mL量瓶中，各精密加入上述對照品儲備液3mL，按照“1.2.3”項下制備供試品溶液，測定峰面積并計算含量，計算回收率、平均回收率及RSD。

1.2.6 耐用性 為了考察色譜條件發生小的變化時，葛根素含量測定結果受影響的程度，分別對流動相比例、柱溫、流速及色譜柱型號等因素進行小的調整，記錄葛根素含量的變化情況。按“1.2.2”和“1.2.3”項下方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，采用單因素考察法，每次調整其中一個因素，依法測定含量。記錄每個因素下的峰面積，并計算葛根素含量及RSD。

1.2.7 樣品測定 取雙葛止瀉口服液樣品（批號為：20170201，20170202，20170203），按“1.2.3”項下的操作方法制備供試品溶液，按上述“1.2.1”項下的色譜條件依法測定，計算樣品中葛根素的含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性考察 按"1.2.5.1"項下進樣分析，結果供試品色譜在與對照品色譜中葛根素主峰相同的位置，有保留時間一致的色譜峰。陰性對照色譜在與葛根素主峰相應的位置處無干擾。結果表明，本方法專屬性良好。見圖1。

2.1.2 線性關系考察 按“1.2.5.2”項下進樣分析，記錄峰面積，繪制標準曲線并計算回歸方程及相關系數，回歸方程為：Y=4765824.5939X-170324.1707（r=0.9999），表明葛根素進樣量在0.1616～1.6159μg范圍內，峰面積與進樣量線性關系良好，結果見表1。

2.1.3 精密度試驗 按“1.2.5.3”項下進樣分析，連續進樣6針，記錄峰面積并計算峰面積的RSD，結果見表2，葛根素峰面積的RSD為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性試驗 按“1.2.5.4”項下進行操作，平行制備6份供試品溶液，依法測定，結果見表3，6份樣品含量測定結果的RSD為1.1%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 溶液穩定性試驗 按“1.2.5.5”項下進行操作，分別在第0、2、4、8和12h進樣分析，計算峰面積的RSD。結果見表4，葛根素峰面積的RSD為0.8%，表明供試品溶液在12h內穩定。

2.1.6 加樣回收率試驗 按“1.2.5.6”項下進行操作，結果6份樣品的回收率在99.73%～101.92%之間，平均回收率為100.5%，RSD為0.8%，表明該方法準確度良好。結果見表5。

2.2 耐用性

按照“1.2.6”項下的方法進行操作。結果表明，通過調整流動相比例、柱溫、流速以及更換不同型號的色譜柱，各條件下葛根素含量測定結果均沒有顯著差異，RSD均符合要求。表明該色譜條件的耐用性良好。結果見表6。

2.3 樣品測定

按照“1.2”項下的操作方法，分別制備對照品溶液和供試品溶液，依法測定雙葛止瀉口服液三批樣品中葛根素的含量，測定結果見表7。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

采用紫外-可見分光度法進行全波長掃描，結果葛根素在250nm處有最大吸收。參考《中國獸藥典》2015年版一部[6]葛根藥材含量測定項及相關文獻報道[7，8]，葛根素的檢測波長多采用250nm。綜合分析，確定葛根素的檢測波長選擇250nm。

3.2 色譜條件的考察

曾參考《中國獸藥典》2015年版一部葛根藥材含量測定項，以甲醇-水（25：75）為流動相，結果該條件下葛根素主峰附近有多個雜峰，且與葛根素主峰分離度不好。根據相關文獻[9，10]，通過在水相中加入磷酸，并對流動相比例進行優化，所得色譜峰峰形較好，陰性對照無干擾。通過不同流動相比例、柱溫、流速、色譜柱的耐用性實驗，葛根素含量均沒有顯著變化，表明本方法的耐用性較好。

本文建立了一種高效液相色譜法測定雙葛止瀉口服液中葛根素含量的方法，并對該方法進行了驗證，結果該方法準確度高、專屬性好，可用于該產品中葛根素的質量控制。

參考文獻：

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