田薊苷固體分散體的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

陳曉敏，崔偉峰，李 琦

(1.鄭州衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450199；2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；3.上海市藥材有限公司，上海 200082)

田薊苷是唇形科香青蘭屬植物主要活性成分[1]，為黃酮類(lèi)化合物，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌缺血、抗腫瘤、抗冠心病、降血脂等藥理活性[2-3]。曾誠(chéng)等[4]報(bào)道，田薊苷為疏水性成分，導(dǎo)致其體外溶出速率慢，累積溶出度低，口服后體內(nèi)吸收受到限制；文獻(xiàn)[5]報(bào)道，田薊苷口服絕對(duì)生物利用度僅為1.35%，并且不存在首關(guān)效應(yīng)，故改善該成分溶解度和溶出度是提高其口服吸收生物利用度首先需要解決的問(wèn)題。目前，已有采用微乳[3]、脂質(zhì)體[5]等技術(shù)的相關(guān)報(bào)道，但存在制備工藝復(fù)雜、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。

固體分散體[6-9]制備方法主要有溶劑法、熔融法、噴霧干燥法等，其中噴霧干燥法操作過(guò)程簡(jiǎn)單，工業(yè)化應(yīng)用程度高，該技術(shù)是通過(guò)將溶液在干燥室中迅速霧化，遇到熱空氣后溶劑迅速汽化，最終得到固體粉末產(chǎn)品[10]。本研究采用該方法制備田薊苷固體分散體，并對(duì)其進(jìn)行體外(晶型、溶解度、溶出度等)[11]和體內(nèi)(藥動(dòng)學(xué)行為)研究，以期為相關(guān)制劑研發(fā)提供參考。

1 材料

AR2240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；安捷倫1260型高效液相色譜儀器(美國(guó)安捷倫公司)；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(常州億能實(shí)驗(yàn)儀器廠)；Tecni 12型透射電鏡(荷蘭Phlips公司)；TENLIN型實(shí)驗(yàn)室超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(江蘇天翔儀器有限公司)；D8型X射線粉末衍射儀(德國(guó)布魯克公司)；QL-902型渦旋混合器(上海滬粵明科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；GIPP-2000型實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī)(上海繼普電子科技公司)；UGC-12MF型氮?dú)獯蹈蓛x(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)。

田薊苷(批號(hào)20190125，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院)。PVP K30(批號(hào)25000240379，美國(guó)Ashland公司)；透析袋(美國(guó)Sigma公司，截留分子量8～14 kDa)。SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2015-0002，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周至體質(zhì)量為(280±20)g。

2 方法與結(jié)果

2.1 固體分散體制備 采用噴霧干燥法。取田薊苷0.35 g，加入70%乙醇1 000 mL，超聲處理15 min后抽濾，繼續(xù)加入1.75 g PVP K30攪拌溶解，設(shè)定噴霧干燥參數(shù)為氮?dú)怏w積流量0.5 m3/min；進(jìn)風(fēng)溫度130 ℃；出口溫度60 ℃；泵體積流量5 mL/min；霧化氣體積流量8.5 L/min；噴嘴孔徑0.508 mm。收集固體粉末，置于30 ℃真空干燥箱中干燥2 d，密封，即得。

2.2 田薊苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Angilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸(55∶45,混勻后抽濾，單泵進(jìn)樣)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)以田薊苷計(jì)，不低于8 000。

2.2.2 線性關(guān)系考察 取田薊苷10 mg，置于100 mL量瓶中，加入約80 mL乙腈超聲處理5 min，靜置至室溫后定容，作為貯備液，質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL,取適量，流動(dòng)相依次稀釋至10、5、1、0.2、0.1、0.02 μg/mL，即得對(duì)照品溶液，各取20 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以田薊苷峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=16.114 8X+0.612 8(r=0.999 6)，在0.02～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 方法學(xué)考察 取低(0.02 μg/mL)、中(1.0 μg/mL)、高(10.0 μg/mL)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得田薊苷峰面積RSD分別為0.16%、0.13%、0.19%，表明儀器精密度良好。取固體分散體約10 mg，置于100 mL量瓶中，加入流動(dòng)相約80 mL，超聲處理5 min，靜置至室溫后定容，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，流動(dòng)相定容，即得供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得田薊苷峰面積RSD為0.39%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取固體分散體適量，制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得田薊苷含量RSD為1.36%，表明該方法重復(fù)性良好。精密稱(chēng)取田薊苷含量已知的固體分散體適量，置于100 mL量瓶中，加入1.6 mg/mL對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5 mL及流動(dòng)相約80 mL，共9份，超聲處理5 min，靜置至室溫后定容，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，流動(dòng)相定容，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得田薊苷平均加樣回收率為100.96%，RSD為1.66%。

2.3 體外溶出度試驗(yàn) 預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空膠囊在溶出介質(zhì)中的崩解時(shí)間約為6.5 min。取田薊苷及其固體分散體適量(相當(dāng)于田薊苷50 mg)，裝入膠囊，以900 mL0.5%SDS為釋放介質(zhì)，超聲法脫氣后注入溶出杯內(nèi)，設(shè)定溫度、轉(zhuǎn)速分別為37 ℃、100 r/min，于10、15、20、30、60、90、120、240 min各取樣3 mL(同時(shí)補(bǔ)充加等量介質(zhì))，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算釋放度，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，田薊苷最大溶出度為33.6%，而物理混合物(藥載比同固體分散體)提高至45.8%；固體分散體在前120 min的溶出率大大提高，240 min內(nèi)累積溶出度達(dá)95.4%。

圖1 田薊苷體外溶出曲線Fig.1 In vitro dissolution curves for tilianin

2.4 晶型分析 取田薊苷、PVP K30、物理混合物(藥載比同固體分散體)、固體分散體適量，置于樣品槽中，玻璃片壓平后進(jìn)行掃描，設(shè)定掃描條件為銅靶，管壓40 kV，管流200 mA，掃描速度5°/min，掃描范圍(2θ)3°～45°，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，田薊苷有較多的晶型衍射峰；PVP K30為無(wú)定型載體；在物理混合物中也能觀察到田薊苷強(qiáng)度較高的特征晶型衍射峰，而強(qiáng)度相對(duì)較弱者被PVP K30掩蔽；固體分散體XRPD圖譜中無(wú)田薊苷晶型衍射峰，表明該成分在固體分散體中以無(wú)定型態(tài)存在，也證明了固體分散體是不同于物理混合物的物質(zhì)。

圖2 各樣品XRPD圖譜Fig.2 XRPD patterns for various samples

2.5 表觀溶解度測(cè)定 取過(guò)量田薊苷、物理混合物(藥載比同固體分散體)、固體分散體適量，加到蒸餾水中，固定于25 ℃恒溫?fù)u床上振蕩2 d，12 000 r/min離心30 min，取上清液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，田薊苷溶解度僅為2.29 μg/mL，而固體分散體提高至29.85 μg/mL；物理混合物中田薊苷溶解度為2.92 μg/mL，可能是由于PVP K30在一定程度上改善了該成分疏水性，但影響程度有限。

表1 各樣品表觀溶解度測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.1 Resulrs of apparent solubility determination of various samples (n=3)

2.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.6.1 灌胃液制備 取固體分散體70 mg，加入0.5%CMC-Na溶液3 mL，即得固體分散體灌胃液；取田薊苷12 mg，加入0.5%CMC-Na溶液3 mL，即得田薊苷灌胃液。

2.6.2 分組及采血 采用拋幣法將大鼠隨機(jī)分為田薊苷組和田薊苷固體分散體組，每組6只，禁食過(guò)夜，自由飲水。按40 mg/kg劑量灌胃給藥后，于0、0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12 h眼眶取血各(0.25±0.05)mL，立即敷上棉球止血，3 000 r/min離心2 min，取血漿，冷凍保存。

2.6.3 血漿樣品處理 血漿樣品在室溫下解凍，精密吸取200 μL至離心管中，加3 mL乙腈渦旋5 min，-4 ℃、8 000 r/min離心15 min，取上清液，45 ℃氮?dú)獯蹈桑尤胍译?00 μL，-4 ℃、8 000 r/min離心15 min，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測(cè)定。

2.6.4 血漿對(duì)照品溶液制備及線性關(guān)系考察 大鼠麻醉后心臟取血，-4 ℃、8 000 r/min離心15 min，作為空白血漿樣品。取5 μg/mL對(duì)照品溶液，稀釋至1 500、1 000、500、100、20 ng/mL，各取500 μL，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL空白血漿，即得血漿對(duì)照品溶液，按“2.6.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測(cè)定。取空白血漿、血漿對(duì)照品、血漿樣品溶液適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3，可知該方法專(zhuān)屬性良好。以血漿樣品峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.034 8X-2.861 7(r=0.999 0)，在20～1 500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.田薊苷1.tilianin圖3 田薊苷HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of tilianin

2.6.5 方法學(xué)考察 取同一份血漿樣品，于0、2、4、8、12、24 h冷凍、溶解后，按“2.6.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得田薊苷峰面積RSD為9.83%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20、500、1 500 ng/mL血漿對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得田薊苷峰面積RSD分別為5.91%、4.53%、4.82%，表明儀器精密度良好。取同一份血漿樣品，平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得田薊苷峰面積RSD為9.08%，表明該方法重復(fù)性良好。取20、500、1 500 ng/mL血漿對(duì)照品溶液，按“2.6.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得回收率為86.53%～93.69%。取血漿對(duì)照品溶液適量，逐步稀釋后在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得定量限為5 ng/mL，檢測(cè)限為2 ng/mL。

2.6.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖4，再采用DAS2.0藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，固體分散體tmax短于田薊苷(P<0.05)，可能是由于固體分散體加快了藥物溶出，同時(shí)溶解度也得到提高，從而使藥物順利吸收、進(jìn)入體循環(huán)的時(shí)間變短；固體分散體Cmax高于田薊苷(P<0.01)，表明該技術(shù)可促進(jìn)藥物吸收；與田薊苷比較，其固體分散體相對(duì)口服吸收生物利用度提高至2.16倍。

圖4 田薊苷血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)Fig.4 Plasma concentration-time curves for tilianin (n=6)

表2 田薊苷主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tilianin (n=6)

3 討論

固體分散體制備方法一般有溶劑法、冷凍干燥法、噴霧干燥法等[12]，其中冷凍干燥法制備時(shí)部分藥物可能仍以晶體狀態(tài)存在，導(dǎo)致促溶效果不理想[13-14]；溶劑法制備時(shí)存在較高的溶劑殘留問(wèn)題；噴霧干燥法制備時(shí)噴出的含藥?kù)F滴可在極短時(shí)間干燥，有助于提高藥物分散性，大大增加藥物比表面積，從而可更大程度地提高溶解度及溶出度。本研究采用噴霧干燥法制備田薊苷固體分散體后，其溶解度提高了13.03倍，溶出度達(dá)到95.4%，可為提高其口服吸收生物利用度奠定基礎(chǔ)。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，固體分散體改變了田薊苷藥動(dòng)學(xué)，其tmax提前(P<0.05)，可能與固體分散體技術(shù)提高藥物溶出速率有關(guān)；Cmax由(339.27±67.81)ng/mL提高至(795.35±104.81)ng/mL(P<0.01)，表明該技術(shù)可促進(jìn)藥物吸收，并且相對(duì)口服吸收生物利用度提高至2.16倍。雖然固體分散體能改善田薊苷溶解度和溶出度不理想的問(wèn)題，但其吸收程度還與本身脂溶性[4]、P-糖蛋白(P-gp)外排作用[3]、體內(nèi)穩(wěn)定性[5]等不利因素有關(guān)，從而限制了促吸收作用和生物利用度的提高程度。今后，對(duì)田薊苷口服制劑的研究可從以下幾個(gè)方面入手①采用提高藥物脂溶性的制劑技術(shù)(如磷脂復(fù)合物)改善透膜吸收，并聯(lián)合固體分散體技術(shù)，以期進(jìn)一步提高生物利用度[15]；②加入抑制P-gp外排作用的藥物或輔料；③采用固體脂質(zhì)納米粒、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體等納米技術(shù)，從而提高藥物體內(nèi)穩(wěn)定性、改變藥物吸收途徑。