棉花耐鹽性鑒定方法探討

蘇 瑩 郭安慧 華金平

(中國農業(yè)大學 農學院/作物遺傳改良北京市重點實驗室/雜種優(yōu)勢利用教育部重點實驗室，北京 100193)

土壤鹽漬化是干旱和半干旱地區(qū)限制作物產量關鍵的環(huán)境因素之一。土壤飽和浸提液電導率≥0.40 S/m的土壤定義為鹽漬土，相當于40 mmol/L NaCl溶液[1]。棉花中等耐鹽(耐鹽閾值為0.77 S/m)，是鹽堿地的先鋒作物。耕地面積減少、我國棉花生產逐漸向鹽堿地集中，選用耐鹽品種、提高鹽堿地棉花產量潛力和穩(wěn)產性是優(yōu)先的技術措施之一，因此生產上對于耐鹽品種的需求日益緊迫。

棉花耐鹽性受基因型影響較大，棉屬中不同棉種之間、陸地棉不同品種之間的耐鹽性表現出顯著差異[2-3]。耐鹽鑒定方法一般分為直接鑒定法和間接鑒定法(表1)[4]。其中，直接鑒定法包括脅迫發(fā)芽法、形態(tài)觀察法和產量比較法；間接鑒定法是應用植物生理學、生物化學和細胞學等手段研究鹽脅迫應答過程的相關因子的變化，以一個或多個因子為指標來衡量耐鹽性。棉花耐鹽分子標記的開發(fā)和應用，也是間接鑒定法[5-7]。種子萌發(fā)期和幼苗期是棉花對鹽脅迫最為敏感的時期。種子萌發(fā)期主要采用相對成活苗率、相對發(fā)芽率、相對鹽害或芽長、根長等指標作為鑒定指標[4,8-9]，而幼苗期采用相對株高和相對葉面積等指標作為鑒定標準；或測定生理生化指標[2-3,10-11]，或在生長發(fā)育不同時期利用主成分分析、聚類分析或隸屬函數法分析多種性狀指標，綜合反映棉花耐鹽性[12-14]。

表1 棉花耐鹽性鑒定方法及指標分類Table 1 Classification of the identification methods and indexes of cotton salt tolerance

本研究綜合分析1990—2021年國內外棉花耐鹽性研究相關報道，擬通過比較、綜合已有研究結果，提出相對簡便快捷、結果穩(wěn)定可靠、統一可比的鑒定方法，以期為開展大規(guī)模棉花材料耐鹽性鑒定提供參考。

1 種子萌發(fā)期鑒定

棉花種子萌發(fā)期耐鹽性鑒定使用的發(fā)芽基質主要有濾紙和沙子，通過比較發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長、芽重、干重和鮮重等性狀指標，或計算相對發(fā)芽率、相對鹽害率、相對成苗率等相對指數來評價棉花的耐鹽性。

1.1 濾紙為基質

葉武威等[15]利用雙層濾紙法包裹浸漲的棉花種子在培養(yǎng)皿中進行耐鹽篩選試驗，結果表明，使用質量百分數為0.70%～1.10%(摩爾濃度為120～188 mmol/L)的NaCl溶液進行棉花萌發(fā)期耐鹽性鑒定更為適宜。謝德意等[16]利用雙層濾紙法，滴加0.00%～1.00%、1.20%、1.50%等13個梯度水平的NaCl溶液，統計發(fā)芽勢和發(fā)芽率，發(fā)現當NaCl濃度>0.50%(85 mmol/L)時，鹽脅迫下發(fā)芽勢和發(fā)芽率與對照差異顯著；NaCl濃度>0.70%(120 mmol/L)時，差異極顯著。張國偉等[17]設置0(CK)、100、150和200 mmol/L的NaCl濃度梯度進行萌發(fā)試驗，確定150 mmol/L NaCl為耐鹽性鑒定的適宜濃度，以鹽害系數隸屬函數值和總隸屬函數值作為供試棉花品種萌發(fā)期的耐鹽性鑒定的依據。類似報道還有，白燈莎·買買提艾力等[18]設置6個NaCl濃度梯度(0(CK)、50、100、150、200和300 mmol/L)，比較新疆27個棉花品種的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，采用模糊數學隸屬函數法進行耐鹽性綜合評價，確定150 mmol/L NaCl溶液作為棉花耐鹽性鑒定濃度。

王俊娟等[19]采用濾紙卷直立包裹浸漲種子發(fā)芽，設置0(對照)、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%和1.40%的NaCl溶液處理，測定棉花發(fā)芽勢、芽長和芽重等指標，結果發(fā)現，影響發(fā)芽勢的NaCl臨界濃度為1.20%，而影響芽長和芽重的NaCl臨界濃度為0.80%。吳振良等[20]采用毛巾卷做為基質用0、0.30%、0.45%和0.60%濃度的NaCl溶液浸濕包裹種子進行萌發(fā)試驗，對14個棉花品種種子進行耐鹽性鑒定，確定該方法適宜的上限NaCl溶液濃度為0.60%。

以濾紙為基質鑒定棉花耐鹽性已有較多應用。利用150 mmol/L NaCl溶液進行棉花種子濾紙發(fā)芽試驗[21]，調查發(fā)芽勢和發(fā)芽率，以相對指數作為耐鹽指標，準確鑒定419份陸地棉材料的耐鹽性。Sun等[22]通過在培養(yǎng)皿中加入0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、和1.20%的NaCl溶液，對‘新陸早17’、‘晉棉8號’、‘豫棉3號’進行耐鹽性鑒定，確定1.00%的NaCl溶液濃度為適宜篩選條件。

1.2 沙培基質

葉武威等[4]以沙子為發(fā)芽基質，利用NaCl濃度為0～1.00%的沙培進行發(fā)芽，以相對成活苗率分為4級作為耐鹽性判定指標：高抗(>90.0%)、抗(75.0%～89.9%)、耐(50.0%～74.9%)和不耐(0.0%～49.9%)。結果發(fā)現0.40% NaCl濃度時棉花成苗率急劇下降，確定0.40%的土壤含鹽量作為棉花生產中鹽脅迫篩選的最佳值。通過模擬自然鹽堿地條件[23-24]設置5個鹽土濃度，利用沙培方法進行萌發(fā)和出苗期耐鹽性鑒定，NaCl濃度為0(對照)、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%(鹽重/干沙干重×100%)。根據7 d后的相對出苗率將棉花萌發(fā)出苗期耐鹽性分為高抗(≥90.0%)、抗(70.0%～89.9%)、耐(50.0%～69.9%)以及不耐(≤50.0%)。結果表明，沙土中0.30% NaCl濃度為影響棉花萌發(fā)的臨界點。沙土中NaCl≥0.30%，種子萌發(fā)受到嚴重抑制，NaCl<0.30%時，處理和對照出苗率無顯著差異。

吳曉東等[25]對102份棉花品種進行耐鹽性篩選，以1.00%的NaCl溶液脅迫種子發(fā)芽率為標準進行耐鹽分級：1級(高抗，H，>90.0%)、2級(抗，R，75.0%～89.9%)、3級(耐，T，50.0%～74.9%)和4級(敏感，S，0.0%～49.9%)，結果發(fā)現種子相對發(fā)芽率、相對棉苗干物質質量和相對株高是棉花萌發(fā)期耐鹽性鑒定的可靠指標。利用石英砂作為基質，澆灌0.30%(摩爾濃度51 mmol/L)的NaCl溶液，調查棉花相對存活率和鹽害指數，從713份的陸地棉自然群體篩選到160份耐鹽品種和18份抗鹽品種[26]。劉瑞顯等[27]通過沙培方式，利用150 mmol/L NaCl溶液進行處理，以棉花萌發(fā)期各個指標的鹽害指數的熵值和權重等指標，進行棉花耐鹽性鑒定。比較上述研究，以沙培發(fā)芽法進行棉花耐鹽性鑒定時，沙土中NaCl含量及標準存在差異，有的以“NaCl重/干沙重”的質量百分數為標準進行鹽脅迫處理，也有以不同摩爾濃度或質量濃度的NaCl溶液澆灌沙土的方法進行脅迫處理，2種方法中，實際NaCl含量難控制，且試驗需要較大空間。

1.3 其他發(fā)芽基質

除上述以濾紙和沙子為發(fā)芽基質鑒定耐鹽性的方法外，陳建平等[28]利用水培方法，設置0.30%～1.50%的NaCl濃度，在布設多個洞穴的泡沫板中填充基質并播種，鑒定棉花萌發(fā)期與苗期耐鹽性。有研究以0.17%～0.23%的NaCl溶液中脫絨消毒種子的“吐芽率”(種子生長點裂開，下胚軸露出開口稱為吐芽)為指標，快速檢測棉花耐鹽性[29]。該方法快速、簡便，但結果的可重復性及其與田間成苗率的相關性需進一步驗證。

2 幼苗期耐鹽性鑒定

棉花出苗后，植株從異養(yǎng)向自養(yǎng)的過渡，鹽脅迫可能引起幼苗畸形，嚴重時葉綠素合成受阻，形成黃化苗。棉苗在二、三葉期體內已開始分化花芽，此時對鹽分最為敏感[30]。因此，棉花幼苗期耐鹽性鑒定一般選擇兩葉或三葉期。已有報道主要以生物量、株高、葉綠素含量、生理生化指標等作為該階段耐鹽性鑒定指標[2-3,10,13]。

2.1 水培鑒定

Guo等[31]采用水培方法，分別以0、50、100、150和200 mmol/L NaCl溶液處理三葉一心期棉花幼苗，發(fā)現150 mmol/L NaCl處理后棉花葉片失水萎蔫，隨時間延長逐漸恢復，確定150 mmol/L是棉花幼苗期耐鹽性鑒定適宜的脅迫處理濃度。通過觀察脅迫后棉花幼苗表型變化，分析脅迫后0.5～72.0 h基因表達的差異情況，確定脅迫后3、12和48 h為棉花脅迫表型及恢復的關鍵時間點[32-33]。利用該方法對陸地棉‘CRI-12’和野生棉‘毛棉’構建的F2∶3群體進行耐鹽性鑒定[34]，脅迫2周后獲得葉綠素含量、苗高、根長、苗鮮重、根鮮重、苗干重和根干重等表型數據，分析幼苗期耐鹽相關QTL。

此外，也有研究通過水培條件[35]，設置100、150、200和250 mmol/L的NaCl濃度梯度，于幼苗三葉期脅迫處理10 d后測定生長指標和生理指標，通過隸屬函數和耐鹽指數分析，確定200 mmol/L NaCl為水培條件篩選適宜濃度，以葉片相對含水量和光合速率作為苗期耐鹽性篩選指標。

2.2 鹽池鑒定

葉武威等[4]通過鹽池篩選6 000余份棉花種質資源，發(fā)現在0.40% NaCl濃度下棉花最敏感，有利于準確鑒定耐鹽性差異，確立了0.40%鹽量脅迫法(又稱鹽池鑒定法)作為棉花種質耐鹽性鑒定方法，并提出行業(yè)鑒定標準。利用0.40%鹽量脅迫棉花三葉期幼苗，調查10 d的成活苗率，將棉花耐鹽性分為4級：高抗(>90.0%)、抗(75.0%～89.9%)、耐(50.0%～74.9%)和不耐(0.0%～49.9%)。

楊陽[36]在含有250 mmol/L NaCl的鹽池中處理兩葉一心期棉花幼苗，處理第5(子葉開始發(fā)黃)、7和9天開始調查統計葉片受害情況及第一片真葉葉綠素含量；第9天測量株高及根、莖、葉干重，根據葉片受害程度，分3級統計供試材料耐鹽性。張香桂等[37]利用穴盤基質，用0、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%和3.00%的NaCl溶液處理兩葉一心期棉苗，處理后3、5和7 d調查子葉受害情況，計算子葉受害指數，分為5級：0級，棉苗無黃葉；1級，1片子葉發(fā)黃；2級，2片子葉均發(fā)黃；3級，1片子葉受害脫落；4級，2片子葉受害脫落。并提出：棉苗2葉期，1.50%～2.00% (257～342 mmol/L)NaCl濃度處理7 d，可用于批量篩選棉花品種苗期耐鹽性。劉雅輝等[38]采用土壤全鹽含量為0.40%的原土鹽池，土壤全鹽含量0.10%為對照，調查出苗至二葉期幼苗長勢及鹽害癥狀，計算鹽害指數，確立棉花苗期(二葉期)耐鹽性評價標準。

3 全生育期耐鹽性鑒定

鹽脅迫最終影響棉花產量和纖維品質，因此在鹽漬環(huán)境比較棉花全生育期的生長情況和產量也可作為鑒定棉花耐鹽性的方法[30,39]。

姜益娟等[39]通過分析土壤含鹽量對棉花產量和品質的影響，結果發(fā)現，土壤總含鹽量與產量、單株有效鈴、單鈴重、株高均呈極顯著負相關。土壤含鹽量<0.24%，對棉花產量及構成因子起促進作用；含鹽量>0.24%，開始產生不良影響；當含鹽量>0.50%時，棉花受害逐漸加重。但土壤鹽分與纖維品質沒有顯著的相關性。Guo等[40]通過播種前以含鹽量0.50%的自然地下鹽水處理耕地，調查土壤鹽分對陸地棉重組自交系群體纖維品質的影響，結果發(fā)現土壤鹽分提高纖維強度，對其他纖維品質性狀無顯著影響。

孫小芳等[41]采用鹽化土壤盆缽全生育期栽培法，設置0、0.15%、0.30%、0.45%和0.60%的NaCl濃度梯度，比較13個陸地棉品種的耐鹽性。結果表明，鑒定棉花耐鹽性的適宜濃度為0.45%(77 mmol/L)，相對籽棉產量可作為鑒定棉花耐鹽能力的可靠簡易指標。

另外，王俊鐸等[42]利用pH 8.50～8.60、可溶性鹽濃度為0.54%的復合鹽堿土對119份國內外陸地棉品種資源進行耐鹽性鑒定，證明了鹽脅迫對衣分、鈴重和葉綠素的影響較小，而對果節(jié)、鈴數和葉面積的影響較大。

4 其他鑒定方法

除利用種子萌發(fā)期和幼苗期鑒定棉花品種耐鹽性外，李付廣等[43]利用棉花組織培養(yǎng)技術，將棉花不同部位組織或細胞培養(yǎng)在加鹽培養(yǎng)基中，離體快速鑒定耐鹽性。Long等[44-45]在棉花幼苗3～4片真葉時，利用葉盤法進行離體耐鹽性鑒定，取相同節(jié)位葉片做成1 cm的葉盤，在濃度分別為0和400 mmol/L的NaCl溶液中孵育4 d，通過觀察葉片顏色變化鑒定耐鹽性。沈法富等[46]利用液滴培養(yǎng)技術(sitting drop culture)，通過統計不同濃度NaCl溶液脅迫培養(yǎng)下花粉萌發(fā)率，反映棉花耐鹽水平。

利用非損傷微測系統鑒定耐鹽性[47-48]，棉花一片真葉時，用含150 mmol/L NaCl營養(yǎng)液處理24 h，利用非損傷微測系統測定根尖的Na+和K+的外排流速，計算Na+/K+外排流速比，Na+/K+外排流速比越大，耐鹽性越強[47]。以棉花三葉期在0.30% NaCl的沙培條件脅迫9 d，基于非損傷微測系統測定Na+離子流，并結合GhSOS1基因表達情況，鑒定棉花品種耐鹽性[48]。

另外，王為等[49]采用室內試驗和室外試驗結合進行耐鹽種質篩選，室內采用質量百分比濃度0.40% 的NaCl進行雙層濾紙法和沙培法發(fā)芽，室外試驗采用鹽池鑒定(NaCl濃度0.00%～0.50%)及海邊重鹽堿土(可溶性鹽含量0.40%～0.80%)，對棉花種質進行多時期、多地點不同水平的耐鹽性鑒定。

此外，鑒定棉花種子萌發(fā)期耐鹽性用到的鹽脅迫種類也有差異。鹽漬土中鹽分類型多樣，如氯化物鹽、磷酸鹽和碳酸鹽等。在耐鹽性鑒定中，普遍使用中性鹽，如NaCl和Na2SO4。但堿性鹽，如NaHCO3和Na2CO3，在鹽漬化土壤中也大量存在。

李雙男等[50]通過設置NaCl、Na2SO4和NaHCO3+Na2CO33種脅迫類型，分析不同鹽堿對棉花種子萌發(fā)的影響。結果發(fā)現，中性鹽Na2SO4較NaCl對棉花種子萌發(fā)表現出更強的抑制作用，堿性鹽在pH 8.60時促進萌發(fā)，pH 9.03時抑制萌發(fā)，pH 10.47時則完全不萌發(fā)。吳巧娟等[51]以鹽堿含量5.90%的海水稀釋至鹽堿含量為0.35%作為處理，以純凈水為對照進行沙培發(fā)芽試驗，第10天統計出苗率計算相對鹽害率作為耐鹽指標。吳新海等[52]通過在地下咸水、NaCl溶液和鹽堿原土3種情況下進行試驗，測定發(fā)芽率、出苗率，結果表明，NaCl溶液中棉花發(fā)芽率偏高，地下咸水溶液和鹽堿原土脅迫發(fā)芽率接近。用NaCl單鹽溶液進行萌發(fā)期耐鹽性鑒定，鑒定濃度為0.50%(摩爾濃度86 mmol/L)較適合；用地下咸水和鹽堿原土進行鑒定，可溶性鹽含量為0.40%較適合；且認為地下咸水最切合生產實際。

5 存在問題及展望

由于不同研究報道中，關于NaCl濃度計算標準不一致(表2)。萌發(fā)階段使用的NaCl質量濃度范圍多為0.30%～1.50%，通過比較，認為適宜的篩選濃度為0.40%～1.00%；而采用摩爾濃度的標準，使用的范圍為100～300 mmol/L，且多數研究表明，適宜的篩選濃度為150 mmol/L的NaCl溶液。

棉花種子萌發(fā)與出苗是田間成苗的關鍵，鹽脅迫下不同基因型的棉花品種發(fā)芽率和出苗率存在顯著差異[14,18,23,30]，因此在萌發(fā)期和幼苗期可直接評價棉花的耐鹽性。綜合已有研究，在萌發(fā)和出苗期，室內條件下，鹽脅迫發(fā)芽或者出苗試驗，鹽脅迫條件容易控制，其中以濾紙為發(fā)芽基質的方法，操作簡單、快速、宜重復，可作為鑒定棉花品種耐鹽性的主要方法，但雙層濾紙法易發(fā)霉，影響鑒定結果。室外條件進行棉花苗期耐鹽性鑒定，多以砂培、土培或鹽堿原土為發(fā)芽基質，用于篩選的NaCl濃度范圍為0.30%～1.20%[4,23]，最高達到2.00%[37]，但參試品種、苗齡及發(fā)芽基質[52]等方面的不一致，均影響鑒定結果。土壤中可溶性鹽含量與鹽種類難以統一，且大田鑒定時，土壤含鹽量也會受氣候影響。因此，室內采用濾紙卷法，以150 mmol/L(質量分數為0.87%，表2)NaCl為適宜脅迫濃度，篩選指標為發(fā)芽率、相對發(fā)芽率或相對鹽害率(表1)，進行耐鹽性鑒定，可作為首選方法。室外條件下采用含鹽量0.40%的鹽池處理棉花三葉期幼苗10 d，統計成活苗率，鑒定棉花苗期耐鹽性。

表2 不同NaCl濃度計量對比Table 2 Comparison of different standards of NaCl concentration

利用自然鹽堿土進行棉花全生育期的耐鹽性鑒定，有利于指導生產實踐，但該鑒定方式缺乏系統性評價。利用田間自然鹽堿土進行鑒定，存在鹽度分布不均勻的情況，且土壤含鹽量受年份和氣候影響較大。由于自然環(huán)境因素的不確定性，如降雨量和積溫等，影響自然鹽堿土的土壤鹽度，降低年份間鑒定結果重復性和精確性，且不同鹽堿地環(huán)境，鑒定結果/趨勢也存在差異，因此室內鑒定與田間鑒定結果可能會出現較大差異，并且該方法測定周期長，成本高。目前新疆是中國棉花的主產區(qū)，利用新疆鹽堿土建立鹽度均勻的鹽池或土壤鹽分均勻的地塊，進行多年多點的全生育期耐鹽鑒定對指導生產實踐有重要意義。