利用SSR標記構建板栗初級核心種質(zhì)

張馨方 張樹航 李 穎 郭 燕 王廣鵬

(河北省農(nóng)林科學院 昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600)

植物種質(zhì)資源是開展遺傳研究和育種工作的關鍵，世界各國都高度重視種質(zhì)資源的搜集、保存和研究利用。隨著搜集到的種質(zhì)數(shù)量日益增多，如何對數(shù)量龐大的資源進行整理保存，如何高效利用現(xiàn)有種質(zhì)資源并實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，是資源管理單位和育種工作者共同面臨的現(xiàn)實問題。鑒于此，F(xiàn)rankel等[1]最早提出核心種質(zhì)的概念，即以最小的資源數(shù)量和遺傳重復最大限度地代表整個種質(zhì)資源的多樣性。核心種質(zhì)是進行優(yōu)良基因挖掘和資源深入研究的核心子集，能夠有效提高資源的利用率。據(jù)報道，目前包括桃(Prunuspersica(L.) Batsch.)[2]、核桃(JuglansregiaL.)[3]、木荷(Schimasuperba)[4]和橄欖(Canariumalbum)[5]等木本植物均已構建了核心種質(zhì)。

中國是栗屬(Castanea)植物的起源中心，也是世界上栗屬植物分布最為廣泛的區(qū)域，主要分布有板栗(C.mollissimaBl.)、錐栗(C.henryi(Skam) Rehd. et Wils.)、茅栗(C.seguiniiDode)和日本栗(C.CrenataSieb. & Zucc)4個種[6]。其中板栗在我國分布最廣且數(shù)量最多，遺傳多樣性也最為豐富，歷來是世界栗屬植物遺傳改良和新品種培育重要的基因資源[6]。板栗屬多年生木本植物，樹體高大，資源保存通常以田間活體種植為主，占地面積大，管理費用高。如何從豐富的板栗資源中快速而準確地挖掘出育種工作所需要的優(yōu)異基因是板栗遺傳育種亟需解決的重要問題。據(jù)此，本研究啟動了構建板栗初級核心種質(zhì)的策略，優(yōu)先對核心種質(zhì)進行繁殖、交換、評價和利用，緩解基因庫中龐大資源數(shù)量與高效保存之間的矛盾，推進優(yōu)異資源利用和優(yōu)良基因挖掘，提高種質(zhì)資源庫的管理和利用水平。

國內(nèi)外學者對核心種質(zhì)的構建方法研究較多，包括基于形態(tài)學指標構建核心種質(zhì)[7-8]、基于隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)數(shù)據(jù)進行標記輔助取樣(Marker-assisted sampling)[9]和利用遺傳距離取樣等方法[10]。表型性狀是多種因素綜合作用的結果，易受外界環(huán)境影響，加之板栗是高大的多年生喬木，要獲得可靠的表型性狀數(shù)據(jù)需要耗費較長年限。而DNA分子標記技術具有高效、快速和穩(wěn)定等優(yōu)點，一般較少受到外界環(huán)境影響，普遍認為是評價植物遺傳多樣性和構建核心種質(zhì)的有效工具。RAPD、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)和簡單重復序列(SSR)等技術[11-13]已被廣泛應用于栗屬植物遺傳多樣性評價方面[14]，Marshall和Brown[15]認為位點的等位基因數(shù)是評價遺傳多樣性最重要的指標。程麗莉[16]利用AFLP分子標記對燕山地區(qū)136份實生板栗進行了遺傳多樣性分析，并初選核心種質(zhì)37份；馬玉敏[17]以板栗野生株系為材料，研究了采用熒光AFLP分子標記構建中國野生板栗核心種質(zhì)的方法；Pereira-Lorenzo等[18]利用SSR分子標記建立了271份歐洲栗(C.sativaMill.)品種的數(shù)據(jù)信息并篩選出37份核心種質(zhì)。但有關中國板栗核心種質(zhì)構建的研究還有待進一步完善，前期研究所選用的材料樣本取樣量小且取樣范圍相對狹窄，沒有涵蓋華北、長江中下游、西北、東南和西南5個地方品種群，遺傳信息不夠豐富。SSR標記是共顯性遺傳，能直接反映出DNA序列水平上的變化，并提供豐富的等位基因信息，較其他標記具有更大優(yōu)勢[19]。本研究利用SSR標記，以品種群分布范圍涵蓋5個地方的279份板栗資源為材料，利用Simple Matching(SM)遺傳相似系數(shù)和Dice遺傳相似系數(shù)進行非加權算術平均聚類法(UPGMA)聚類，比較位點優(yōu)先取樣法和隨機取樣法的不同，確定構建板栗初級核心種質(zhì)的適宜方法，并篩選出板栗初級核心種質(zhì)，以期為板栗種質(zhì)資源的管理、保存和開發(fā)利用提供科學依據(jù)，有效提高整個行業(yè)資源利用率和育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

資源植株全部定植于河北省農(nóng)林科學院昌黎果樹研究所板栗種質(zhì)資源圃(119°15′ E，39°72′ N)，屬溫帶半濕潤大陸性氣候區(qū)，年平均氣溫11 ℃，年平均降水量638 mm，無霜期186 d。所有資源是在中國板栗5個地方品種群分布范圍內(nèi)選取的實生良種、地方品種或古樹資源，2004年統(tǒng)一嫁接入圃保存。供試材料為來自河北、山東、北京、陜西、湖南、湖北、江蘇、浙江、安徽、貴州、廣西和廣東12個省(市或自治區(qū)) 的279份板栗種質(zhì)。2018年5月，每個植株選取嫩葉5 ～ 6片，置入裝有硅膠的塑封袋帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩９┰嚥牧厦Q及來源地見表1。

表1 供試板栗資源名稱及其來源Table 1 Chestnut materials used in the experiment and their origins

表1(續(xù))

表1(續(xù))

1.2 SSR分析

采用改良的CTAB法[20]提取板栗葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度，于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩１狙芯繌?20對引物中篩選出擴增產(chǎn)物多態(tài)性較高且條帶清晰的21對引物用于全部樣品分析，引物具體信息、PCR反應體系及擴增條件參見文獻[21]。用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，用銀染法[22]染色。根據(jù)DNA marker大小，按照引物設計目標產(chǎn)物條帶讀取序列長度，在相同遷移位置上，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

1.3 初級核心種質(zhì)構建

利用NTSYS Version 2.10軟件，根據(jù)SM遺傳相似系數(shù)和Dice相似系數(shù)采用UPGMA法對擴增結果進行聚類分析。SM系數(shù)和Dice系數(shù)是一種相似性配對系數(shù)，即相似匹配數(shù)與總匹配數(shù)的比值[23]，具體計算方法見表2。

表2 遺傳相似系數(shù)計算方法Table 2 Calculation methods of two genetic similarity coefficients

本研究采取多次聚類的方法，以隨機取樣法[26]為對照，應用位點優(yōu)先取樣策略[27]構建初級核心種質(zhì)。位點優(yōu)先取樣策略即根據(jù)聚類樹狀圖，在最低分類水平的2份遺傳材料中選取稀有等位基因數(shù)較多的材料進入下一輪聚類。若2份材料稀有等位基因數(shù)目相等，則優(yōu)先選擇稀有等位基因頻率值更小的材料，如果這2個值仍相等則隨機選擇1份材料，若組內(nèi)只有1份材料則直接進入下一輪聚類。隨機取樣法即在最低分類水平的2份材料中隨機選取1份進入下一輪聚類。

1.4 初級核心種質(zhì)有效性分析檢驗

對原種質(zhì)、保留種質(zhì)和初級核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)進行t檢驗，以此評價初級核心種質(zhì)的代表性。Ne是反映群體遺傳變異程度的指標，與等位基因頻率有關，而H和I都是反映群體遺傳多樣性水平的重要參數(shù)。以上數(shù)據(jù)采用POPGENE Version 1.32和SPSS 20.0軟件進行分析。

1.5 主坐標分析與表型特征確認

基于SSR數(shù)據(jù)信息，利用NTSYS Version 2.10軟件中的EIGEN模塊對初級核心種質(zhì)的代表性進行主坐標分析，判定初級核心種質(zhì)是否在主坐標圖中均勻分布。

初級核心種質(zhì)基本形態(tài)學指標檢測按照《板栗種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[28]進行，從樹姿、枝干顏色、皮孔大小和皮孔密度、葉片顏色和形狀、葉緣形狀、花芽形態(tài)和大小以及邊果形狀方面對初級核心種質(zhì)進行評價，以此評價初級核心種質(zhì)的代表性。樹姿包括直立、半開張、開張和披垂；枝干顏色包括紅褐、灰褐和綠褐；皮孔大小和花芽大小包括小、中和大3種類型；皮孔密度包括稀、中和密；葉片顏色分為濃綠、灰綠、黃綠和紫紅色；葉片形狀分為橢圓形、闊披針形和披針形；葉緣形狀分為鋸齒形和鈍齒形；花芽形態(tài)包括扁圓形和圓形；邊果形狀包括橢圓形、圓形和三角形。

使用數(shù)顯游標卡尺(精確度為0.01 mm)和電子天平(精確度為0.01 g)對原種質(zhì)和初級核心種質(zhì)的堅果縱徑、堅果橫徑、堅果厚度、單粒質(zhì)量、果殼質(zhì)量和果殼厚度6個性狀進行測定。參照Hu等[26]評價方法，若均值差異百分率(MD)<20%，同時極差符合率(CR)>80%，可認為核心種質(zhì)能代表原種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

(1)

式中：n為數(shù)量性狀總數(shù)；St為核心種質(zhì)與原種質(zhì)t測驗得到的均值差異顯著的性狀數(shù)。

(2)

式中：n為數(shù)量性狀總數(shù)；RC(i)為核心種質(zhì)某個性狀的極差；RI(i)為原種質(zhì)同個性狀的極差。

2 結果與分析

2.1 初級核心種質(zhì)構建

由表3可知，除根據(jù)Dice系數(shù)第1輪聚類后隨機取樣法取得的樣本Ne值略高于位點優(yōu)先取樣法，其他無論利用SM系數(shù)還是Dice系數(shù)聚類，均為位點優(yōu)先取樣法得到的種質(zhì)Ne、H和I高于隨機取樣法。因此，構建板栗初級核心種質(zhì)時位點優(yōu)先取樣法要優(yōu)于隨機取樣法。此外，隨著聚類次數(shù)的增加，聚類抽樣得到的樣本數(shù)越來越少，占原種質(zhì)比例越來越低，而Ne、H和I卻隨聚類次數(shù)的增加越來越大。

應用位點優(yōu)先取樣法，279個樣本使用SM系數(shù)經(jīng)過3次聚類抽樣后(表3)，得到了由68份種質(zhì)組成的核心樣本群SA3，占原種質(zhì)的24.37%，Ne、H和I分別為1.539、0.329和0.502；利用Dice系數(shù)聚類，全部樣本經(jīng)3次聚類，得到一個由31份種質(zhì)組成的核心樣本群DA3，占原種質(zhì)的11.11%，Ne、H和I分別為1.562、0.341和0.517。

2個核心樣本群SA3和DA3遺傳多樣性各指標與原種質(zhì)的t檢驗結果見表4。SA3和DA3樣本群的Ne、H和I在概率0.05水平上顯著大于原種質(zhì)，說明篩選出的2個核心樣本群遺傳多樣性較豐富。從資源來源地看，樣本群DA3包括的種質(zhì)數(shù)量較少，地理來源較單一；而樣本群SA3種質(zhì)來源更豐富，包括原資源來源地10個省(市或自治區(qū))，由此初選種質(zhì)SA3為板栗核心種質(zhì)。綜上，采用位點優(yōu)先取樣法，利用SM相似系數(shù)進行3次聚類選取的68份種質(zhì)，范圍涵蓋了原材料各主要來源地，經(jīng)檢驗能夠代表279份原種質(zhì)的遺傳多樣性，確定為板栗初級核心種質(zhì)的最佳取樣策略。

2.2 初級核心種質(zhì)有效性分析檢驗

保留種質(zhì)指從原種質(zhì)中去除核心種質(zhì)后剩余的部分，它可以作為核心種質(zhì)的后備資源。對初級核心種質(zhì)與原種質(zhì)和保留種質(zhì)的遺傳多樣性進行評價，以此判定初級核心種質(zhì)代表性。初級核心種質(zhì)和保留種質(zhì)遺傳多樣性各指標見表5。結果顯示，初級核心種質(zhì)保留了原種質(zhì)24.37%的樣品，Ne、H和I分別為1.539、0.329和0.502，均高于原種質(zhì)各遺傳多樣性指標。由此可見，本研究篩選出的初級核心種質(zhì)在遺傳多樣性上能較好地代表原種質(zhì)。保留種質(zhì)保留了原種質(zhì)75.63%的樣品，Ne、H和I分別為1.504、0.305、0.468。再對初級核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的Ne、H和I值分別作t檢驗(表4)，初級核心種質(zhì)Ne、H和I在概率0.05水平上顯著大于保留種質(zhì),因此，應優(yōu)先考慮應用初級核心種質(zhì)資源進行遺傳研究工作。

表3 板栗不同樣本群遺傳多樣性比較Table 3 Genetic diversity analysis of different collections of China chestnut

表4 2個核心樣本群與原種質(zhì)、初級核心種質(zhì)與保留種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)的t檢驗Table 4 Gentic diversity comparison and t-test between two core sample group and initial collection, primary core colletion and reserved collection

表5 初級核心種質(zhì)和保留種質(zhì)、原種質(zhì)遺傳多樣性對比Table 5 Genetic diversity comparison and t-test between core collection, reserved collection and initial collection

2.3 初級核心種質(zhì)主坐標分析與表型特征評價

采用主坐標法(PCoA)對篩選出的初級核心種質(zhì)進行確認，繪制原種質(zhì)與初級核心種質(zhì)1、2主坐標散點圖(圖1)，可見初級核心種質(zhì)在整個板栗資源的主坐標圖分布均勻，表明篩選出的初級核心種質(zhì)具有較好的代表性。

橫縱坐標分別表示貢獻率較高的1、2主坐標。 Horizontal and vertical coordinates mean the first two principal coordinates with higher contribution rate respectively.圖1 位點優(yōu)先取樣法構建的初級核心種質(zhì)與原種質(zhì)的主坐標圖Fig.1 Principal coordinates plots of primary core collection constructed by preferred sampling strategy and initial collection

本研究構建的68份初級核心種質(zhì)的編號分別為1、2、8、10、12、15、17、24、26、40、44、46、50、51、53、54、57、59、65、66、76、92、94、98、101、116、118、123、125、128、147、149、151、158、160、161、166、173、174、177、180、183、185、186、191、203、209、214、215、222、223、231、232、233、238、242、244、254、255、256、260、263、264、269、270、271、275和277，68份初級核心種質(zhì)名稱及來源地見表1。68份種質(zhì)在樹姿、枝干顏色、皮孔大小、皮孔密度、葉片顏色和形狀、葉緣形狀、花芽形態(tài)和大小以及邊果形狀10個方面涵蓋了分類學的大多數(shù)或全部類型。此外還包括紅栗、垂枝栗、三色栗、波葉栗和短枝型板栗等具有特殊性狀的資源，驗證了本研究篩選出的初級核心種質(zhì)的合理性。

初級核心種質(zhì)與原種質(zhì)6個表型特征數(shù)據(jù)見表6。經(jīng)t檢驗核心種質(zhì)6個表型性狀均值與原種質(zhì)無顯著差異，根據(jù)公式計算出MD和CR分別為0和81.13%，符合胡晉等[29]提出的核心種質(zhì)均值同原種質(zhì)群體存在顯著差異的性狀<20%、核心種質(zhì)與原種質(zhì)的極差符合率>80%的最低標準。研究結果從表型水平上證明了根據(jù)SM系數(shù)聚類結合位點優(yōu)先取樣法是構建板栗初級核心種質(zhì)較適宜的方法。

表6 初級核心種質(zhì)與原種質(zhì)6個堅果表型特征基本參數(shù)Table 6 Basic parameter value of 6 phenotypic traits of primary core collection and initial collection

3 討論與結論

在明確資源分子遺傳信息數(shù)據(jù)的基礎上，本研究應用聚類分析的方法構建核心種質(zhì)，因為具有最大遺傳相似度或最近遺傳距離的材料自然聚在一起，而去除遺傳距離較近的材料后可得到遺傳特性差異較大的種質(zhì)材料。目前，基于遺傳距離聚類的取樣方法已經(jīng)建立并應用于植物核心種質(zhì)的構建當中[10，30-31]。研究表明，選擇不同遺傳相似系數(shù)導致分析結果存在較大差異，因為遺傳系數(shù)的選擇會影響遺傳相似度或遺傳距離的計算，因此，選擇合適的遺傳相似系數(shù)對于準確估計個體間遺傳相似度和評價群體間遺傳多樣性至關重要[23]。劉娟等[32]研究認為，構建新疆野杏核心種質(zhì)時采用Dice遺傳距離要優(yōu)于SM遺傳距離；張春雨等[27]認為，根據(jù)SM、Jaccard或Dice遺傳距離進行多次聚類構建新疆野蘋果核心種質(zhì)均為較適宜的方法，并提出了對于共顯性分子標記如SSR和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)，利用Dice和Jaccard相似系數(shù)更為理想。本研究采用SM遺傳系數(shù)和Dice系數(shù)通過多次聚類的方法構建板栗初級核心種質(zhì)，結果表明利用Dice系數(shù)取得的核心樣本數(shù)量最小，卻具有較大的Ne、H和I，說明從遺傳系數(shù)的選擇而言，Dice系數(shù)對SSR標記更合適，符合張春雨等研究結果。但考慮到采用Dice系數(shù)構建的核心樣本群地理來源范圍較單一，未能包括所有樣本來源地，而利用SM系數(shù)構建的核心樣本群來源地涵蓋原種質(zhì)10個省(市)，在遺傳多樣性上能夠以最小的樣本量最大程度地代表原種質(zhì)，因此本研究優(yōu)先采用SM遺傳相似系數(shù)進行聚類分析。

取樣策略是核心種質(zhì)構建中又一重要環(huán)節(jié)。李自超等[33]通過研究水稻核心種質(zhì)的構建方法發(fā)現(xiàn)聚類法要優(yōu)于隨機法。通常不能采用在整個群體內(nèi)完全隨機的方法進行取樣，因為一個物種的遺傳多樣性是以某種特定組織和結構分布，而不是完全隨機地分布在整個群體中[34-35]。Quero-Garcia等[36]在構建芋頭核心種質(zhì)研究中，比較了完全隨機法取樣、組內(nèi)完全隨機法取樣和組內(nèi)先聚類后取樣的方法，結果表明組內(nèi)先聚類后取樣是一種比前兩者更加有效的方法。本文即采用先聚類后取樣的方法，研究表明無論選擇何種遺傳系數(shù)聚類，通過位點優(yōu)先策略取得的樣本均比隨機取樣法具有較大的Ne、H和I，這說明構建板栗初級核心種質(zhì)時位點優(yōu)先取樣法優(yōu)于隨機取樣法，與前人的研究結果一致[27，32]。可能是物種的基因多樣性是決定其表型性狀的遺傳因子，而所有位點的等位基因頻率和等位基因數(shù)目構成了資源基因多樣性的基礎。等位基因數(shù)目和頻率承載著原種質(zhì)的遺傳多樣性，而稀有等位基因可能具有某種有利特性來幫助該物種適應不同的環(huán)境變化，防止群體衰落，在生物多樣性中具有重要意義[37-39]。因此，建議在構建核心種質(zhì)時優(yōu)先選取稀有基因(等位基因頻率小于5%)，同時盡可能地保留原種質(zhì)等位基因的多樣性，這樣既可以減少等位基因的丟失，又盡可能保留原種質(zhì)群體的基因多樣性。

樣本量的規(guī)模是衡量核心種質(zhì)是否合理有效的重要因素。核心種質(zhì)是以最小的資源數(shù)量最大程度地代表整個資源的遺傳多樣性，因此確定最優(yōu)的取樣比例十分關鍵。李自超等[40]提出應根據(jù)具體植物的遺傳結構和數(shù)量規(guī)模來確定相應的取樣比例。目前國內(nèi)外構建的核心種質(zhì)所占比例一般為原種質(zhì)的5%～30%，其中作物群體一般原種質(zhì)資源數(shù)量較多，選取較小規(guī)模的核心樣品也能充分保留原種質(zhì)的遺傳特性。如稻類等農(nóng)作物核心樣品一般占總收集品的10%左右[41-42]，而園藝植物核心種質(zhì)取樣規(guī)模一般在20%左右[32]。取樣比例應根據(jù)具體樹種遺傳特性和原種質(zhì)資源數(shù)量和實際工作而定。對遺傳多樣性豐富和資源數(shù)量大的群體可適當減小取樣比例。本研究選取68份初級核心種質(zhì)占原種質(zhì)的24.37%，來源涵蓋了中國板栗5個地方品種群分布范圍，能充分代表原種質(zhì)的遺傳多樣性。此外，本研究從主坐標和形態(tài)學角度對構建的初級核心種質(zhì)進行確認，發(fā)現(xiàn)初級核心種質(zhì)遍布整個主坐標圖，在表型特征方面能代表原群體，通過位點優(yōu)先取樣策略結合SM相似系數(shù)多次聚類確定的24.37%的取樣比例是合理有效的。建議板栗行業(yè)優(yōu)先對這部分初級核心種質(zhì)進行繁殖、交換、評價和利用，以促進各地板栗基因交流，提高整個行業(yè)資源利用率和育種效率。而對于資源保存單位來說，這部分初級核心種質(zhì)的確定可以提高整個種質(zhì)資源庫的管理、保存和利用水平。盡管理論上本研究構建的初級核心種質(zhì)在遺傳多樣性方面能最大程度地代表整個供試板栗資源，但其他種質(zhì)資源仍具有重要的保存意義。因為本研究僅是借助21對SSR引物對其遺傳多樣性進行了初級地挖掘，今后隨著對資源評價內(nèi)容的拓展和評價水平的提高，資源遺傳多樣性將得到進一步挖掘，從中仍可能篩選出極具利用潛力的基因資源，其他植物對非核心種質(zhì)的留存亦可參考如此。

本研究所選用的279份資源取材于中國板栗主產(chǎn)區(qū)的12個省(市或自治區(qū))，涵蓋傳統(tǒng)分類學上劃定的中國板栗5個地方品種群，是迄今為止進行中國板栗核心種質(zhì)群構建選用材料(樣本)數(shù)量較多且覆蓋面較廣的研究。盡管如此，本研究也存在原種質(zhì)取樣不均的問題，其中華北品種群的資源數(shù)量相對較多，其他品種群樣本相對較少，可能遺漏部分具有潛在利用價值的種質(zhì)資源，因此本研究選用樣本在代表中國板栗資源的全部遺傳信息方面仍有欠缺。此外，由于針對資源表型特征的檢測數(shù)據(jù)相對簡單，在以后研究中還需要補充和完善質(zhì)量性狀表型保留或數(shù)量性狀特征值方面數(shù)據(jù)，以此來進一步驗證核心種質(zhì)的代表性及合理性。