四川省食品動物源大腸桿菌mcr-1與ESBLs基因共轉移分析

仇劍宇 舒 剛 楊承霖 甘 婷 林居純

(四川農業大學 動物醫學院，成都 611130)

多黏菌素類是醫學臨床上治療多重耐藥陰性菌感染的關鍵抗生素，被認為是臨床用藥最后一道防線[1]。上世紀80年代初，多黏菌素在我國被批準用于養殖業，作為藥物飼料添加劑以防治動物腸道感染和促進生長[2]。在較長一段時間，臨床檢測發現細菌對多黏菌素的耐藥性維持在較低水平，且耐藥性由染色體介導，只能垂直傳播[3]。近年來，耐藥性監測發現食品動物源細菌對多黏菌素耐藥率明顯上升。2015年Liu等[4]首次從豬源大腸桿菌攜帶的質粒中檢出mcr-1基因，且發現該基因編碼的MCR-1蛋白能導致細胞質膜上脂質A被磷酸乙醇胺共價修飾，使細菌細胞外膜與多黏菌素親和力下降，導致對多黏菌素類耐藥。此后，在全球各地，包括患者、環境、食品、家養和野生動物源分離菌中均檢出mcr-1[5]。回顧性監測發現，早在上世紀80年代，我國雞源大腸桿菌中就存在mcr-1。隨時間推移，該基因檢出率呈爆發式上升，尤其在食品動物源菌株中檢出率非常高[3,5]，如2018年我國豬源大腸桿菌中mcr-1檢出率高達76.2%[6]。通過動物源和人源mcr-1陽性菌株分子特性比較發現，通過食物鏈、水等自然環境或與動物直接接觸，該基因存在從動物擴散到人的可能，這給公共安全造成了威脅[5]。

研究表明，攜帶mcr-1的質粒類型具有多樣性，最常見有IncI2，IncHI2和IncX4型質粒。這些質粒可以在腸桿菌科細菌間發生接合轉移，其中IncI2和IncHI2可同時攜帶ESBLs、PMQR和其他耐藥基因，導致多耐藥基因共轉移[7-8]。多耐藥基因共轉移會造成在使用其他抗生素時，也會對mcr-1產生選擇作用，使得mcr-1的擴散和耐藥問題更加嚴重。四川省是中國畜牧業大省，養殖規模逐年擴大，多重耐藥菌株的出現嚴重威脅著畜牧生產的健康發展。大腸桿菌作為食品動物體內最常見的致病菌和共棲菌，是耐藥性傳播的重要細菌，也是目前報道最易攜帶mcr-1的菌種，約占mcr-1陽性菌株91%[5]，可將多耐藥基因傳遞給其他致病菌，甚至通過環境、食品等再傳播給其他動物和人類。因此，調查大腸桿菌中耐藥基因的流行情況，對四川省的耐藥性檢測是非常重要的。本次研究以四川省各地收集的不同動物源大腸桿菌為對象，檢測mcr-1以及超廣譜β-內酰胺酶ESBLs基因流行情況，通過質粒接合轉移試驗揭示耐藥基因發生共轉移的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 菌株

190株大腸桿菌于2017—2018年從四川省不同養殖場患病豬、雞、兔體內分離鑒定獲得，其中156株雞源大腸桿菌，25株豬源大腸桿菌，9株兔源大腸桿菌；質控菌ATCC25922和耐疊氮鈉大腸桿菌J53 AZr由中國農業大學基礎獸醫學系獸醫藥理學教研室惠贈。

1.2 主要試劑

氨曲南等購自四川制藥制劑有限公司；小量質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；2×Taq PCR MasterMix等購自成都擎科梓熙生物技術有限公司。

1.3 藥物敏感性試驗

采用微量肉湯稀釋法檢測190株大腸桿菌對氨芐西林(AMP)、頭孢噻肟(CTX)、氨曲南(ATM)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、環丙沙星(CIP)和多黏菌素E(COL)最小抑菌濃度(MIC)，以大腸桿菌ATCC25922株作為質控菌株。藥敏折點參考CLSI-M100-S29[9]和EUCAST9.0標準判讀[10]。

1.4 菌株mcr-1及ESBLs基因檢測

采用E.Z.N.A.?Plasmid DNA Mini Kit I提取190株大腸桿菌的質粒DNA。mcr-1陽性菌株的ESBLs基因(blaTEM、blaCTX-M-1 group、blaCTX-M-2 group、blaCTX-M-9 group、blaCTX-M-8/25 group、blaSHV和blaOXA)采用PCR檢測，靶基因、引物序列等見表1。PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至成都擎科梓熙生物測序，將獲得的耐藥基因序列和GenBank核酸序列進行BLAST比對。

1.5 質粒接合轉移試驗

將mcr-1陽性大腸桿菌(供體菌)與大腸桿菌J53 AZr(受體菌)進行肉湯接合試驗。接合子用含藥(2 μg/mL多黏菌素E和200 μg/mL疊氮鈉)胰蛋白胨大豆瓊脂平板進行篩選[14]。采用微量肉湯稀釋法檢測接合子藥物敏感性，提取接合子質粒DNA擴增相關耐藥基因。

1.6 數據統計及分析

使用SAS9.0軟件FREQ程序進行耐藥率組間差異性分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株mcr-1基因檢測及耐藥分析

190株大腸桿菌的mcr-1檢出率為36.84%(70/190)(圖1)，其中，雞源和豬源菌株mcr-1檢出率分別為41.67%(65/156)和20.00%(5/25)，尚未在兔源菌中檢出該基因。

表1 mcr-1及ESBLs基因擴增引物信息Table 1 Information of specific primers for mcr-1 and ESBLs genes

M，DNA標記DL 2 000；1～2，mcr-1陰性菌株； 3～6，mcr-1陽性菌株 M， DNA Marker DL 2 000； 1-2, mcr-1 negative strain； 3-6, mcr-1 positive strain 圖1 部分雞源大腸桿菌mcr-1基因PCR擴增Fig.1 PCR amplifications of mcr-1 of E.coli in chickens

藥敏試驗顯示，190株菌除對慶大霉素(GEN)耐藥率為27.37%，對其余藥物的耐藥率均超過30%，其中對氨芐西林(AMP)高達95.79%，其次是氨曲南(ATM)65.26%、多黏菌素E(COL)47.89%、頭孢噻肟(CTX)35.26%、阿米卡星(AMK)32.63%和環丙沙星(CIP)32.11%。比較mcr-1陽性和陰性菌株的耐藥性可見，mcr-1陽性菌株對氨曲南(ATM)、頭孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐藥率極顯著高于mcr-1陰性菌(P<0.01)，對其他藥物的耐藥率差異均不顯著(P>0.05)(圖2)，其中mcr-1陽性大腸桿菌對多黏菌素E(COL)耐藥率高達92.9%。

2.2 mcr-1陽性菌的ESBLs基因檢測

70株mcr-1陽性菌攜帶質粒大小約為2 kb>15 kb，75.71%菌株檢出了ESBLs基因。測序結果顯示，blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14的檢出率分別為71.43%、22.86%和17.14%，未檢出其他ESBLs基因(圖3)。

2.3 mcr-1陽性菌株的質粒接合轉移分析

mcr-1陽性菌株質粒接合轉移率為47.14%(33/70)。33株mcr-1陽性接合子及其供體菌的MICs、耐藥率比較可見，接合子及其供體菌對多黏菌素E的MIC在2～8 μg/mL，說明菌株對多黏菌素E(COL)呈低水平耐藥。接合子對頭孢噻肟(CTX)、氨曲南(ATM)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AKM)、環丙沙星(CIP)和多黏菌素E(COL)的MIC50值低于供體菌，但兩者的MIC90值和耐藥率無顯著性差異(表2)。

**表示差異極顯著(P<0.01)，ns表示差異不顯著(P>0.05)。 ** indicates extremely significant difference (P<0.01). ns indicates no significant difference (P>0.05). AMP：氨芐西林；CTX：頭孢噻肟；ATM：氨曲南；GEN：慶大霉素；AMK：阿米卡星；CIP：環丙沙星；COL：多黏菌素E AMP： ampicillin； CTX： cefotaxime； ATM： aztreonam； GEN： gentamicin； AMK： amikacin； CIP： Ciprofloxacin； COL：Colistin 圖2 mcr-1陽性和陰性菌株耐藥率比較Fig.2 Comparison of resistant rates between mcr-1 positive and negative strains

M，DNA標記DL2 000；(a)-1、(b)-1、(c)-1、(d)-4為陽性菌株；其余為陰性菌株。 M， DNA Marker DL2 000； (a) -1， (b) -1, (c) -1 and (d) -4 were positive strains； The rest were negative strains.圖3 β-內酰胺類基因(ESBLs)PCR 擴增Fig.3 PCR amplifications of β-lactamase genes (ESBLs)

對33株接合子基因檢測顯示，19株接合子只檢出mcr-1基因，14株同時檢出mcr-1和ESBLs基因，其中同時檢出blaTEM-1(13株)、blaCTX-M-55(9株)和blaCTX-M-14(2株)；與供體菌相比，盡管14株共轉移接合子對慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AKM)、環丙沙星(CIP)等藥物的MIC值僅為供體菌的1/2或1/32，但卻是受體菌J53 AZr的幾十甚至幾百倍，而且保留了對多黏菌素、β-內酰胺類藥物較高的耐藥率(表3)；分析接合子質粒可見，大小分別約為5、8和>15 kb質粒，其中～5 kb質粒僅攜帶mcr-1，～8和～>15 kb質粒同時攜帶mcr-1和ESBLs基因(表3)。

3 討論與結論

隨著抗生素的長期使用或濫用，耐藥性問題已成為全球公共安全最嚴重的威脅之一。“One health”理念中，動物在“人類—動物—環境”整體健康中占重要地位。目前對食品動物源細菌耐藥性監測，更注重那些在醫學臨床使用的關鍵藥物，如第三代頭孢、氟喹諾酮類和多黏菌素等[15]。本研究耐藥性檢測結果顯示，四川省食品動物源大腸桿菌除對氨芐西林、慶大霉素、環丙沙星等獸醫臨床常用藥物耐藥外，對頭孢噻肟、氨曲南、阿米卡星等獸醫臨床未批準使用的藥物也呈嚴重耐藥性(耐藥率范圍32.63%～65.26%)。這說明耐藥性的產生不僅與抗菌藥物使用強度有關，可能還與不同抗菌藥物間存在交叉或共耐藥相關[16]。

表2 33株接合子(TCs)及其供體菌的MIC50，MIC90及耐藥率Table 2 MIC50, MIC90 and resistant rate of 33 transconjugants and their donors

表3 14株供體菌和接合子(TCS)的MICs、攜帶質粒大小及ESBLs基因Table 3 The MICs, plasmid size and ESBLs gene of 14 donors and their transconjugants (TCs)

表3(續)

本研究中190株食品動物源大腸桿菌中mcr-1檢出率達36.84%，其中雞源和豬源菌株中mcr-1檢出率分別為41.67%和20.00%，高于華東地區雞源菌株檢出率36.66%[17]，與廣東等5省2011—2014年豬源菌株檢出率21%接近[4]，低于我國其他省份豬、雞源菌株該基因的檢出率(43.86%～76.20%)[6,18]，說明在我國食品動物源大腸桿菌中mcr-1廣泛存在，但該基因流行存在地區差異。

研究表明，mcr-1可以與其他耐藥基因共存在[19]。本研究從70株mcr-1陽性菌中檢出75.71%菌株攜帶ESBLs基因，這與其他報道認為mcr-1常與ESBLs共存在和共轉移一致[19-21]。這也詮釋了mcr-1陽性菌株比陰性菌株對第三代頭孢類具有更強的耐藥性的原因。目前，在我國食品動物源大腸桿菌中blaCTX-M是ESBLs最主要的基因型，其中以blaCTX-M-55和blaCTX-M-14為主[17,22]。本研究在mcr-1陽性菌株中blaCTX-M-55和blaCTX-M-14的檢出率分別達22.86%和17.14%，與本研究發現的2010—2016年菌株blaCTX-M基因流行以blaCTX-M-55和blaCTX-M-14為優勢基因型相符，所編碼的CTX-M酶介導對青霉素類和第3代頭孢菌素耐藥[23]。此外，mcr-1陽性大腸桿菌中blaTEM-1檢出率高達71.43%，說明blaTEM-1在四川省食品動物源大腸桿菌中已經獲得了穩固存在和傳播的能力。盡管blaTEM-1介導窄譜β-內酰胺酶，但由于該基因容易發生突變導致新的TEM酶出現，擴大水解底物譜，導致多重耐藥菌株流行[24]。

R質粒作為介導耐藥基因轉移的可移動元件，在耐藥性水平傳播中發揮重要作用。本研究中70株mcr-1陽性菌經質粒接合轉移獲33株接合子(轉移率47.14%)，其中14株發生了mcr-1與ESBLs基因共轉移，且參與菌株耐藥性的表達，使受體菌對多黏菌素和β-內酰胺類藥物產生耐藥性。關于37株mcr-1陽性菌株未結合轉移成功，可能是菌株攜帶的質粒屬于非結合型質粒，需要通過轉化或轉導方式在不同菌株間傳播。

綜上所述，本研究表明在四川省食品動物源大腸桿菌耐藥性較嚴重，且對醫學臨床使用的關鍵藥物也呈耐藥性。耐藥菌株中mcr-1流行率較高，與ESBLs基因共存在較普遍，耐藥基因借助質粒易發生水平傳播，導致多重耐藥菌株的產生和流行。這給動物、人類或環境造成巨大威脅，動物養殖業應加強mcr基因與其他耐藥基因的監測，針對耐藥性問題采取嚴格防控措施，謹慎和合理有效地使用抗生素，緩解耐藥性的產生和傳播，保障動物養殖健康發展和畜禽產品質量安全。