農用植物酵素液中梨樹腐爛病菌拮抗細菌的篩選和防病效果

郁帆, 馮瑩, 韓劍,2, 盛強, 孫麗英, 羅明,2*

(1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區高校農林有害生物監測與安全防控重點實驗室，烏魯木齊 830052；3.新疆巴音郭勒蒙古自治州農業科學研究院，新疆 庫爾勒 841003；4.西北農林科技大學植物保護學院，陜西 楊凌 712100)

庫爾勒香梨(簡稱香梨)(Pyrussinkiangensi)是一個地域性極強的地方特色品種，主要分布在新疆巴州庫爾勒和阿克蘇地區，是新疆林果產業的重要組成部分。隨著香梨產業的發展、種植規模的擴大和栽培模式的改變，多種病害相繼發生，成為影響香梨生產的突出問題[1]。由梨黑腐皮殼菌(Valsapyri)引起的梨樹腐爛病是梨樹栽培生產中最重要的真菌病害之一，在國內梨主產區均有分布，尤其在香梨上危害最為普遍且嚴重，重病園病株率高達77.8%～100%[2]。在梨樹結果期持續低溫、凍害或夏季高溫、干燥及管理不當等導致樹勢衰弱會加重病害發生，造成樹皮腐爛、枝干潰瘍或干枯、大量果樹死亡甚至毀園。隨著樹齡的增加，腐爛病逐年加重，嚴重威脅香梨產業的健康發展[3]。

梨樹腐爛病主要通過刮除病斑、噴施或涂抹化學農藥進行防治。目前國內尚無防治梨樹腐爛病的專用藥劑，生產上常用石硫合劑、腐植酸銅、甲基硫菌靈和甲硫萘乙酸等化學藥劑進行防治，但使用后病斑復發率仍達20%～30%，病害難以根除[4]。當前生產中農藥使用次數增多，亂施濫用問題突出，不可避免地造成病原菌抗藥性增加、果品農藥殘留超標和環境污染等一系列問題，因此，生物防治是現代林果生產發展的必然選擇。發掘對病原菌具有抑菌作用的有益微生物，利用其活體及其活性物質研制成生物菌劑防治植物病害，選擇性強且病原菌不易產生抗藥性，具有安全高效、環境友好等突出優勢。利用生防菌防治果樹腐爛病國內外開展了一些研究，但多數研究圍繞著蘋果腐爛病的防控展開，集中于從果樹和藥用植物內生菌、果樹根際和果園土壤微生物中篩選腐爛病病原菌的拮抗菌，如婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)、埃及青霉(Penicilliumegyptiacum)[5]、螺旋毛殼(Chaetomiumspirale)[6]、極長鏈霉菌(Streptomyceslongissimus)[7]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[8]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[9]等，在抗菌機理、拮抗菌發酵條件優化、室內毒力和田間防效試驗等方面取得了一定研究成果[10]。但有關梨樹腐爛病的生物防治研究鮮見報道。

農用植物酵素是利用蔬菜、藥用植物、水果、果皮、果渣和農業廢棄物等多種植物源材料為主要原料加入糖(蜜)和水，經天然發酵或接種菌劑發酵制成的微生物制品。酵素發酵技術于20世紀90年代由日本引入我國。在種植業生產中的應用實踐表明，農用植物酵素將有機廢棄物資源化利用，且制作簡單、成本低廉、安全環保，在農作物、蔬菜、果樹上葉噴或根施具有活化植物營養、改良土壤結構、促進植物生長、提高產量、改善品質等突出功效，展現了其良好的應用價值與推廣前景[11]。近年來，酵素液對植物病蟲害的生物防治作用得到人們的關注。酵素液中的抗菌活性成分對植物土傳病害和葉面病原菌具有明顯的抑制作用，可顯著提高作物抗病害能力[12]，表現出良好的應用潛力。本研究針對梨黑腐皮殼菌，以前期從各種農用植物酵素液中分離出的酵素細菌為材料，從中篩選具有較強抑菌活性的拮抗菌株，明確其抑菌作用方式，測定其防病效果，為發掘生防資源、安全防控梨樹腐爛病提供科學基礎，對于促進梨產業的健康可持續發展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1酵素液細菌 本課題組在前期研究中從新疆庫爾勒市阿瓦提鄉、哈拉玉宮鄉等地采集農戶以各種果蔬、中草藥植物(香梨、蘋果、西瓜、甜瓜、甘草、蒲公英、香蔥、大蔥等)為原料自制的酵素發酵液，采用稀釋平板分離法從中分離、純化出68個細菌菌株。

1.1.2病原菌 梨黑腐皮殼菌(Valsapyri)菌株XJ005由新疆農業大學林學與園藝學院林木病理學實驗室從庫爾勒香梨腐爛病病樣中分離、鑒定并保存，經測定為強致病力菌株。

1.1.3培養基 營養瓊脂培養基(NA)、營養肉湯培養基(NB)、馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)。

1.2 梨黑腐皮殼菌拮抗菌株篩選

1.2.1拮抗菌的初篩 采用平板對峙培養法進行拮抗菌的初篩。將活化好的梨黑腐皮殼菌接種于PDA平板，25 ℃恒溫培養5 d后用滅菌打孔器沿菌落邊緣取直徑約6 mm的菌餅，接種在PDA平板(直徑90 mm)中央，再將待篩選的細菌菌株點接于距平板邊緣20 mm處等距離的上、下、左、右4個位置，以只接種梨黑腐皮殼菌的平板作為對照，每菌株重復測定3皿，置于25 ℃培養箱培養，待對照組菌落長滿平板，觀察并記錄有無抑菌圈產生并用十字交叉法測量處理病原菌菌落直徑，計算抑菌率。試驗重復3次，初篩出對梨黑腐皮殼菌有明顯拮抗作用的細菌菌株。

1.2.2拮抗菌的復篩 ①拮抗菌發酵液的制備：將初篩拮抗菌株在NA平板上活化后，用接種環移取一環接入裝有50 mL NB培養液的250 mL三角瓶中，150 r·min-1、28 ℃恒溫振蕩培養1～2 d，至細菌發酵液OD600為0.8～1.0。

②發酵液抑菌作用測定：濾紙片法。在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病菌菌餅，在距培養皿邊緣20 mm處上、下、左、右4個位置放置直徑為5 mm的滅菌濾紙片，每紙片滴加5 μL初篩拮抗菌的發酵液，以加入5 μL NB培養液的處理作為對照，每處理重復3皿，25 ℃暗培養3 d后十字交叉法測量病原菌菌落直徑(mm)，計算抑菌率。

抑菌率=[(對照病原菌菌落直徑-處理病原菌直徑)/(對照病原菌直徑-6)]×100%

(1)

③除菌發酵濾液的抑菌作用測定：牛津杯法。將初篩拮抗菌株發酵液在4 ℃條件下10 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，得到除菌發酵濾液。抑菌作用的測定用濾紙片法。

1.3 梨黑腐皮殼菌孢子萌發率測定

1.3.1梨黑腐皮殼菌孢子萌發率測定 在香梨果園采集腐爛病發病枝條，切取帶有梨黑腐皮殼菌分生孢子器的樹皮組織保濕，待分生孢子角溢出后，以香梨果實煎汁為培養液，制備成濃度為106個·mL-1的孢子懸浮液。將拮抗菌發酵液或除菌發酵濾液與孢子懸浮液各取25 μL滴在載玻片中央，并置于裝有1%水瓊脂的培養皿中密封，以滅菌培養基與孢子懸浮液混合為對照，每處理3個重復。25 ℃恒溫保濕，分別于12、24和36 h后顯微鏡下觀察記錄孢子萌發情況，計算孢子萌發抑制率。

孢子萌發抑制率=[(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/(對照孢子萌發率)]×100%

(2)

1.3.2梨黑腐皮殼菌菌絲生長觀察 將活化的梨黑腐皮殼菌菌餅接種于PDA平板中央，拮抗菌株點接于四周，25 ℃恒溫對峙暗培養，以未接種拮抗菌的梨黑腐皮殼菌菌絲作為對照。觀察拮抗菌菌落和梨黑腐皮殼菌菌落之間產生的抑菌帶，5 d后挑取抑菌圈邊緣的梨黑腐皮殼菌菌絲，在光學顯微鏡(LWD300-38LFT)下觀察其形態變化并拍照。

1.4 離體枝條法測定拮抗菌株對腐爛病的防效

在庫爾勒市香梨果園采集香梨樹當年生枝條，剪取粗細一致、長30 cm的枝段，無菌水沖洗三次后用75%乙醇溶液浸泡5 min，晾干，兩端封蠟防止水分散失。用手術刀切出直徑為5 mm的圓形傷口，取一小塊(約1 cm2)滅菌的脫脂棉蘸取1 mL拮抗菌發酵液(OD600=0.8～1.0)或不同稀釋倍數的除菌發酵濾液貼在傷口部位，用保鮮膜包裹保濕，24 h后再接種新鮮培養的梨黑腐皮殼菌菌餅(Ф=5 mm)1塊，每個枝條2個接種點，重復5個枝條。同法設置先用滅菌的脫脂棉蘸取1 mL無菌培養基貼敷枝條傷口，保濕24 h后再接種梨黑腐皮殼菌菌餅的處理為對照。將處理后的枝條放置在塑料托盤中，盤底鋪有加無菌水的滅菌吸水紙，盤口覆蓋保鮮膜保濕，于25 ℃恒溫培養箱中培養，觀察記錄腐爛病的發生情況。7 d后測量病斑大小并按照公式計算病斑面積，統計防治效果。

病斑面積=π×病斑長邊半徑×病斑短邊半徑

(3)

防治效果=[(對照病斑面積-處理病斑面積)/對照病斑面積]×100%

(4)

1.5 拮抗菌株的鑒定

1.5.1形態及生理生化特征鑒定 參照《常用細菌系統鑒定手冊》[13]和《伯杰細菌鑒定手冊》[14]進行形態及生理生化特征測定。將拮抗菌株劃線接種于NA培養基，28 ℃培養24 h，觀察并描述菌落形態特征。革蘭氏染色觀察菌體形態及染色反應；芽孢染色觀察芽孢形狀及著生位置。采用北京陸橋技術股份有限公司的微量生化鑒定管測定菌株的VP、MR、H2S、硝酸鹽還原、葡萄糖產氣、接觸酶、氧化酶、淀粉水解、明膠液化、丙二酸鹽、吲哚試驗反應及對乳糖、木糖、果糖和甘露糖等碳源的利用。

1.5.216S rRNA和gyrA基因序列測定及系統樹發育分析 以細菌基因組柱式提取試劑盒(天根)提取的基因組DNA為模板進行擴增，16S rRNA的上、下游引物分別為27F：5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTG-TTACGA-3′，gyrA基因的上、下游引物分別為F：5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′和R：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′。PCR反應體系為50 μL：模板DNA、Taq聚合酶和dNTPs各1 μL，上、下游引物各1.5 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 39 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃終延伸7 min。PCR產物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產物經1%瓊脂糖凝膠檢測后提交上海生工生物工程有限公司完成測序。測序結果在GenBank中進行同源性比對，利用MEGA 5.05軟件以鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 農用植物酵素液細菌對梨黑腐皮殼菌的抑菌作用

通過平板對峙，從分離于各種植物酵素液的68株細菌中初篩出15株對梨黑腐皮殼菌具有拮抗作用的菌株，抑菌率為41.25%～74.14%(表1)。

表1 農用植物酵素液細菌對梨黑腐皮殼菌抑菌作用初篩結果

其中，gjfn2、gjfn4、PFN41、PFN30、PGY-FX65、X2FN25和YC-FX74具有較強的抑菌作用，抑菌率在70%以上。gjfn4的抑菌效果如圖1所示。

A：菌體與Valsa pyri對峙培養；B：發酵液與Valsa pyri對峙培養；C：除菌發酵濾液與Valsa pyri對峙培養；D：正常生長的梨黑腐皮殼菌

通過濾紙片法、牛津杯法測定初篩菌株發酵液和發酵除菌濾液的抑菌作用，對拮抗菌株進行復篩，gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67抑菌作用顯著，發酵液和發酵除菌濾液的抑菌率均分別大于70%和60%，顯著高于其他11個菌株(表2)。因此,選取gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67做進一步研究。

表2 農用植物酵素液細菌對梨黑腐皮殼菌抑菌作用的復篩

2.2 拮抗菌對梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發和菌絲生長的抑制作用

2.2.1對分生孢子萌發的抑制作用 測定gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67發酵液和除菌發酵濾液對梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發的抑制作用，結果(表3)表明，4個拮抗菌株發酵液和除菌發酵濾液對梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發有明顯的抑制作用，可顯著降低梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發率。其中，gjfn4和PFN41對梨黑腐皮殼菌分生孢子的抑制作用最為顯著，在發酵液和除菌發酵濾液中36 h分生孢子不能萌發，抑制率均達到100%。

表3 拮抗菌株發酵液和除菌發酵濾液對梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發的抑制效果

2.2.2拮抗菌株對梨黑腐皮殼菌絲生長的抑制作用 將拮抗菌株gjfn4與梨黑腐皮殼菌對峙培養5 d后顯微觀察(圖2)顯示，對照梨黑腐皮殼菌菌絲生長正常，菌絲較細、均勻一致、表面光滑、平直；而受gjfn4抑制的梨黑腐皮殼菌菌絲生長異常，如菌絲加粗、顏色變深、不規則彎曲增多、分枝增加、節間短、頂端膨大、畸形、部分膨大細胞破裂、細胞質外滲等。

A：正常菌絲；B～C：gjfn4作用后的畸形菌絲

2.3 拮抗細菌對梨樹腐爛病防治效果

采用離體枝條法測定拮抗菌株gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67發酵液和除菌發酵濾液對梨樹腐爛病的防效，結果(表4)表明，未接種拮抗菌的對照在接種梨黑腐皮殼菌1～2 d后枝條上出現典型病斑，并迅速擴展；而噴施gjfn2、gjfn4、PFN41、PGY-FX67發酵液和除菌發酵濾液后再接種病原菌的處理能有效抑制病斑的擴展速度、減緩顯癥時間(3 d后)，且病斑面積均顯著低于對照。4個菌株發酵液的防效均達到79%以上，除菌發酵濾液原液防效均達73%以上，發酵液防效略高于除菌發酵濾液。4個菌株中，gjfn4菌株發酵液、除菌發酵濾液原液和除菌發酵濾液50倍稀釋液的防效分別為84.79%、81.57%和67.27%，防效最佳。

表4 拮抗細菌對梨樹腐爛病的離體枝條防效

2.4 拮抗菌株的鑒定

2.4.1形態特征及生理生化特性 對拮抗菌株gjfn2、gjfn4、PFN41、PGY-FX67的形態特征、生理生化特性進行觀察測定，結果(表5)表明，4個菌株在菌落、菌體形態和生理生化特性上均符合芽孢桿菌屬特征。gjfn2、gjfn4和PFN41菌株在NA培養基上菌落均呈圓形、乳白色，表面粗造、邊緣不規則，菌體桿狀，G+，芽孢中央位；在VP、甲基紅、H2S、革蘭氏染色、硝酸鹽還原、葡萄糖產氣、接觸酶、淀粉水解、明膠液化、丙二酸鹽、吲哚試驗中均呈陽性反應；氧化酶、乳糖、木糖、甘露糖試驗中均呈陰性反應；其特性與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)一致。PFN41在NA培養基上菌落稍隆起、芽孢囊彭大，甲基紅、H2S、丙二酸鹽試驗呈陰性反應，氧化酶試驗呈陽性反應，其特性與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)一致。

表5 拮抗菌株的形態和生理生化特性

2.4.216S rRNA和gyrA基因序列分析 以菌株gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67的總DNA為模板進行16S rRNA的PCR擴增，均得到一條大小約為1 500 bp的條帶，經測定序列全長分別為1 438、1 438、1 440和1 438 bp，GenBank登錄號分別為MW255029、MW255046、MW255043和MW266937。將測序結果在NCBI數據庫中與已知序列進行BLAST比對，并下載與其相近序列構建系統發育樹，結果(圖3)表明，菌株PGY-FX67、PFN41和gjfn4聚為一類，同時又和gjfn2、貝萊斯芽孢桿菌C1聚在一個分支，與貝萊斯芽孢桿菌模式菌株NRRL B-41580T相似性最高，達99.8%～99.9%。

圖3 基于16S rRNA構建的4個拮抗菌株的系統發育樹

貝萊斯芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌枯草亞種(B.subtilissubsp.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌為相近種，序列相似性高于物種劃分推薦的閾值(98.65%)。因此，僅通過16S rRNA基因序列分析不能有效區分。進一步對供試菌株的持家基因gyrA進行擴增，分別獲得了1 000 bp左右的特異性目標條帶，提交GenBank獲得登錄號分別為MW316629、MW316630、MW316631、MW316632。系統發育分析(圖4)顯示，gjfn2、PGY-FX67菌株與B.velezensisONU 553(CP043416)的序列相似性達100%；gjfn4菌株與貝萊斯芽孢桿菌B.velezensisCBMB205(NZ_CP011937)的序列相似性達到100%；PFN41號菌株與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensPG12(KC797584)的序列相似性達到100%。綜合培養性狀、形態及生理生化特征，將gjfn2、gjfn4、PGY-FX67鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，PFN41鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖4 基于gyrA基因構建的4個拮抗菌株的系統發育樹

3 討論

酵素液發酵過程中有豐富的復合菌群參與，產生多種營養及有機酸、酚類、活性酶、生物表面活性劑等活性物質[15]，具有改善植物營養和抗菌殺蟲的功效。近期，本課題組從西、甜瓜酵素液細菌中分離到XG-FX22和G-FX12菌株，對梨腐爛病的防效顯著高于內生細菌[16]，由此表明，酵素液是獲得高效拮抗菌的重要來源。本研究從新疆庫爾勒果農利用各種果蔬原料經天然發酵制備的酵素液中分離的68株細菌中，采用平板對峙試驗初篩選出了15株對梨黑腐皮殼菌具有拮抗作用的菌株，篩選概率達22.1%；抑菌率為41.25%～74.14%，其中有7個菌株的抑菌率大于70%。通過發酵液和除菌發酵濾液復篩出4株抑菌效果顯著的菌株，通過香梨離體枝條測定其防病效果，結果表明，4個菌株的發酵液防效均達到79%以上，除菌發酵濾液防效均達到73%以上。其中gjfn4菌株的發酵液和除菌發酵濾液防效俱佳，均達到80%以上，且除菌發酵濾液50倍稀釋液的防效仍能保持在60%以上，具有作為香梨腐爛病生防菌的良好潛力。本研究結果再次證實了在酵素液中存在有大量的拮抗菌株，是獲得高抗菌活性菌株的新來源。

近年來，農用植物酵素液在抑制病原菌生長、增強植物抗病性方面的功效不斷地被研究發現和認知。耿健等[17]利用芳香植物孔雀草、薄荷發酵制成的酵素液噴施梨樹，能有效防治梨黑心病、腐爛病和輪紋病的發生，對梨樹葉片生長、光合特性和果實品質均具有促進作用。黃偉菁等[18]證實噴施蘋果幼果酵素液能夠明顯促進樹體生長，改善果實品質，減少α-法呢烯的含量，降低蘋果虎皮病的發生率。王榮娟等[19]發現在蘋果樹上噴施蘋果果實酵素液，可提高活性氧含量和抗氧化酶活性，有效誘導蘋果葉片對斑點落葉病的抗性。但在應用植物酵素過程中也發現，由于原料成分多樣、參與天然發酵的菌種復雜、易污染有害雜菌、復合菌群發酵過程易受環境影響、代謝產物難以控制等因素而造成酵素質量良莠不齊、使用效果不穩定等問題[20-21]。制作植物酵素液是一個復雜的發酵過程，在多種菌種復合共同作用下，使發酵基質產生一系列的生物化學變化，形成抗氧化物、有機酸、酶類和次生代謝產物等抗菌成分。由于發酵菌種不同、原料不同、工藝不同，所以發酵過程中相關代謝產物的變化也不盡相同，但參與發酵的菌種與酵素液的生防功能密不可分。因此，從酵素液中篩選出抗菌功能菌株，對于明確其功能性成分和發酵機理、產品質量調控及開發利用都具有重要意義。研究發現，自然發酵的植物酵素液中分離出的菌種通常是酵母菌和醋酸菌、乳酸菌等[22]。朱會霞等[23]通過高通量測序檢測水果酵素發酵過程中的細菌變化，發現正常發酵主要的細菌有醋酸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、酸硫桿狀菌、明串珠菌和嗜酸菌。本研究從酵素液分離細菌中篩選出的4株梨腐爛病生防潛力菌株均為芽孢桿菌屬，經鑒定gjfn2、gjfn4、PGY-FX67為貝萊斯芽孢桿菌，PFN41為解淀粉芽孢桿菌。這可能是由于芽孢桿菌廣泛棲息于植物體表、體內和空氣、水等環境中，在酵素液發酵過程中生長快，抗逆性強，耐受高酸、高滲透壓環境，能產生多種抗菌物質，因而在發酵過程中與有害菌的競爭中更具優勢。貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌是目前備受關注的重要生防細菌，具有對多種植物病原菌的抗菌活性及促進植物生長的作用[24-25]，但對梨腐爛病防治作用研究尚未見報道。

拮抗菌株對梨黑腐皮殼菌的抑制作用研究表明，4個拮抗菌株的發酵液和除菌發酵濾液可顯著降低梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發率。顯微觀察顯示，拮抗菌造成梨黑腐皮殼菌菌絲加粗、不規則彎曲增加、頂端膨大畸形及細胞原生質外滲。離體防效試驗結果表明，拮抗菌株的發酵液和發酵除菌濾液對香梨腐爛病的防效接近，說明其代謝產物在防病過程中起重要作用。呂前前等[26]研究發現，解淀粉芽孢桿菌菌株BaA-007對蘋果腐爛病菌的作用機制是分泌次生代謝物和激活JA、SA、ET和細胞壁相關抗性反應抑制腐爛病斑擴展。程超[27]從產酶溶桿菌(L.enzymogenes)OH11次生代謝產物中分離的HSAF(heat stable antifungal factor)對梨黑腐皮殼菌有較強的生長抑制作用，EC50值為0.5 μg·mL-1。利用微生物次生代謝物開發生物農藥，可實現規模化生產，耐貯性好，功效穩定，對防控植物病害更具應用價值和發展前景。本研究從植物酵素液中篩選獲得的梨腐爛病生防潛力菌株，其田間防效是否理想有待進一步驗證。同時，菌株的抑菌機制及抑菌物質的成分、結構及穩定性等都需在今后工作中進行更加深入的研究。