宏基因組二代測序技術在臨床病原學診斷中的應用*

戴媛媛，馬筱玲

(中國科學技術大學附屬第一醫院檢驗科，合肥 230000)

臨床病原學診斷的常規方法有鏡檢、培養、抗原/抗體檢測和核酸檢測。依賴傳統方法約有25%～60%的感染性疾病病原體不能明確診斷[1-5]。二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)是相對于一代測序技術而言的新型測序方法[6]，可以同時測定幾百萬甚至上億條核酸序列，其優勢是通量高、敏感性高。在微生物檢測中，NGS技術可用于宏基因組測序、全基因組測序、轉錄組測序、目標基因測序等。宏基因組二代測序(metagenome next-generation sequencing，mNGS)技術指采用NGS技術對特定標本中所有核酸序列進行測序。本文重點討論mNGS技術在臨床病原學診斷中的應用。

1 mNGS在病原體檢測中的應用

mNGS能全覆蓋檢測細菌、支原體、衣原體、螺旋體、立克次體、真菌、病毒和寄生蟲等所有病原體[7-10]。與傳統方法比較，mNGS在病原體檢測方面有如下優勢。

1.1檢測新發未知病原體 近年來，不同病毒間的交叉重組、重配所導致的新發傳染病暴發越來越頻繁。傳統PCR檢測技術的瓶頸是需要根據已知病原體序列信息預先設計引物，而mNGS能夠對臨床樣本中的所有核酸序列進行無偏倚測序，能快速鑒定新發病原體。如2019年12月15日在中國武漢出現不明原因肺炎患者，就是使用mNGS迅速在患者肺泡灌洗液標本中檢出冠狀病毒，并完成全基因組測序[11-12]。據此，世界衛生組織(World Health Organization,WHO)于2020年1月12日命名該病毒為新型冠狀病毒(2019-nCoV)[13]。由此可見，mNGS在2019-nCoV的發現和鑒定中發揮重要作用。

1.2檢測罕見病原體 罕見病原體感染是臨床非常棘手的難題，由于常規檢測方法不能覆蓋，往往導致誤診或漏診。2014年Wilson等[14]報道一名14歲的男孩，持續發熱和頭痛，繼而進展為腦積水和癲癇，在4個月的時間里3次到醫療機構就診，做了包括腦組織活檢在內的38項病原學檢查，均未發現病原體，最終運用mNGS技術診斷為鉤端螺旋體腦膜炎。2015年，Wilson等[15]利用mNGS診斷1例巴氏阿米巴導致的腦膜炎。隨后有多例利用mNGS檢出罕見病原體的報道：如Mai等[16]在16歲腦炎男孩的尿液中檢出日本腦炎病毒；Fung等[17]在異基因造血干細胞移植患者血液中檢出沙眼衣原體；Du等[18]在11歲女孩的呼吸道標本中檢出西尼羅河病毒等。以上研究表明，mNGS技術極大地增強了罕見病原體的檢出能力，是感染性疾病診斷領域的一次革新和飛躍。

1.3檢測跨物種傳播病原體 隨著全球化進程，曾經局限于小范圍、特定物種的病原體越來越多地發生跨地域、跨物種傳播。mNGS可揭示先前無法區分的動物來源和人類來源病原體的差異，可追蹤潛在的人獸共患疾病起源[19]。如Sachsenr?der等[20]使用mNGS檢測了野生老鼠的腸道標本，發現標本中有博卡病毒、沙波病毒、諾如病毒和輪狀病毒等多種病原體，其中輪狀病毒A株的序列與人類致病密切相關。Ai等[21]通過mNGS診斷了一名女性因直接接觸豬的污染物而感染豬皰疹病毒導致眼內炎。

1.4檢測混合感染病原體 傳統微生物檢驗具有偏向性，只能檢出部分病原體，而mNGS可無偏向性地同時檢出所有感染的病原體，為患者明確診斷節省了時間。顧鵬等[22]報道，對37例使用免疫抑制劑的感染患者使用mNGS檢測，發現有31例是混合感染，病原體包括肺孢子菌、巨細胞病毒、皰疹病毒、細環病毒和細菌等。

1.5檢測培養陰性的細菌/真菌性病原體 針對細菌和真菌感染，公認的“金標準”檢測方法是培養，但由于抗菌藥物的應用、標本運送不及時、培養基及培養條件選擇不正確等因素可能導致培養陰性。Yao等[23]報道使用mNGS在3例常規培養陰性的腦脊液中檢出產單核李斯特菌。Dai等[24]報道在1例2次血培養陰性的患者血液標本中檢出豬鏈球菌。此外，某些細菌/真菌用常規方法難以培養或不能培養，也可以通過mNGS進行檢測，如軍團菌[25]、肺孢子菌[26]等。

2 mNGS在感染性疾病診斷中的應用

從成本效益考慮，輕癥感染以及使用傳統檢測方法能夠明確診斷的感染，如尿路感染、皮膚軟組織感染，不推薦使用mNGS檢測。從技術本身的局限性考慮，人源性細胞較多或背景菌較多的感染標本，如糞便標本，不推薦使用mNGS檢測。mNGS技術的主要臨床適應癥如下。

2.1重癥感染的診斷 臨床常見的重癥感染有膿毒癥、腦炎/腦膜炎、重癥肺炎等。對于這些感染，mNGS技術有較高的臨床應用價值，能夠快速、精準地找到病原體。Crumaz等[27]通過對比健康志愿者與膿毒癥患者的mNGS測序結果，發現在膿毒癥患者血液標本中病原菌指數絕對值、豐度顯著升高，且其變化與治療效果密切相關；斯坦福大學急診醫學中心納入580例臨床診斷為膿毒癥的患者，驗證血漿中游離DNA用于病原測序檢測診斷效能，結果發現mNGS對膿毒癥病原學診斷陽性率遠高于培養(48.6% vs 18.1%)，有超過85%的mNGS檢測第2天可報告結果，有53.7%的報告檢出超過1種以上的微生物[28]；Xie等[29]研究發現mNGS可以早期確定重癥肺炎患者的病原體，指導抗菌藥物的應用，改善重癥肺炎患者的病死率。關鴻志教授團隊應用mNGS在腦脊液中檢出人皰疹病毒[30]、新型隱球菌[31]、布魯菌[32]等多種病原體。

2.2慢性感染的診斷 慢性感染通常反復發作，較難治愈。由于慢性感染的癥狀不典型，機體間斷性排菌，臨床實驗室檢測困難。Wilson教授借助mNGS診斷1例患有慢性復發性腦膜炎16年的患者，發現其病原體為豬帶絳蟲，后續血清學實驗也支持其診斷[33]。Huang等[34]利用mNGS診斷1例慢性骨關節結核感染。

2.3疑難復雜感染的診斷 因mNGS檢測無偏倚性和全覆蓋性，對疑難感染病例診斷具有重要作用。如1例非洲務工回國人員出現反復發熱、頭痛、嗜睡，華山醫院張文宏團隊用mNGS技術對其腦脊液進行檢測，最終確診為錐蟲病，給予針對性治療后患者痊愈出院[35]；深圳市第三人民醫院用mNGS確診了1例罕見阿米巴腦炎[36]。

2.4免疫缺陷患者感染的診斷 免疫缺陷患者容易發生機會致病菌感染和混合感染，而且感染的病原體復雜多樣，診斷困難。Wang等[37]對108例免疫抑制患者的臨床標本進行mNGS檢測，該技術顯示出良好的診斷潛力，不受免疫抑制程度的影響，指導抗菌藥物治療的成功率顯著高于經驗用藥組(81.8% vs 52.6%)。Ye等[38]報道1名2歲粒單細胞白血病患兒干細胞移植后出現嚴重的皮疹和高熱，細菌培養和PCR均未檢測出病原體，利用mNGS檢測血液標本后發現痤瘡丙酸桿菌是其感染的病原菌，進行針對性治療后病情好轉。Parize等[39]報道一項多中心前瞻性研究，應用mNGS檢測免疫缺陷患者的鼻咽拭子、穿刺液及血液等標本，結果顯示mNGS較傳統培養法有較高的檢出率(36% vs 11%)，有更高的陰性預測值(98.4%)。

3 mNGS檢測影響因素及結果判讀

隨著測序技術的發展，測序本身不再是瓶頸，關鍵是分析前和分析后質量控制以及檢驗人員和臨床醫師對mNGS檢測影響因素的了解和對檢測結果的合理應用。

3.1mNGS檢測靈敏度及影響因素 mNGS檢測靈敏度是指單位體積標本中檢測到1條病原體序列所需要的病原體個數。需要的病原體個數越少，則靈敏度越高。mNGS檢測靈敏度與測序數據量(檢測總序列數)及致病微生物基因組的堿基數呈正相關，與單位體積標本中人源細胞含量及背景微生物基因數呈負相關。所以，提高mNGS靈敏度的有效方法是增加測序數據量、采取適當的方法去除人源性細胞、嚴格控制標本質量、減少環境和試劑中的背景微生物等。在測序數據量確定的情況下，以下因素可影響mNGS檢測靈敏度。

(1)病原體基因組越大，mNGS檢測靈敏度越高。病原體基因組由大到小的順序是：寄生蟲>真菌>細菌>病毒。

(2)mNGS檢測的是細胞外游離DNA(cell free DNA,cfDNA)，胞內寄生病原體(如布魯菌、傷寒沙門菌等)因其胞外cfDNA較少，檢測靈敏度較低[6]。

(3)細胞壁厚的細菌，如新型隱球菌、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)，難以破壁，核酸提取效率低，mNGS檢測靈敏度低。標本中不同病原體核酸提取效率由高到低的順序是：病毒>革蘭陰性細菌>革蘭陽性細菌>真菌、MTB。

(4)常規的DNA宏基因組測序方法不能檢測RNA病毒，如果懷疑RNA病毒(如乙型腦炎病毒、流感病毒、輪狀病毒、冠狀病毒等)感染要采用宏轉錄組測序。與來自細菌和宿主的RNA相比，RNA病毒遺傳物質的豐度相對較低且容易降解，因此，mNGS對RNA病毒的檢測靈敏度較低。

(5)臨床標本中人源細胞占比越高，mNGS檢測靈敏度越低。一般而言，人源細胞占比由少到多的順序是：腦脊液<肺泡灌洗液<血漿<痰液<胸腹水。即使是同一種類型的標本，若來源于不同個體，或來源于同一個體不同取材方法或不同取材時間，人源性細胞的比例都會相差幾個數量級。有些標本如糞便、壞死組織等，因背景太雜，在目前的技術背景下不適合做mNGS檢測。

(6)臨床標本中背景微生物占比越高，mNGS檢測靈敏度越低。背景微生物主要由定植和污染微生物組成，其中定植微生物指能在人體一定部位定居、生長和繁殖的微生物。背景微生物不僅影響mNGS的結果，對傳統病原學檢測結果也有影響。由于mNGS檢測靈敏性高，可在原本認為無菌的部位檢出微生物序列，如健康人血液，因此，需通過大數據分析，建立不同類型標本的背景微生物庫，定期更新，并設立基線，解讀規則，以區分致病微生物和定植微生物。污染微生物指在標本取材或實驗室檢測過程中混入的環境微生物，可通過規范取材方法、設置陰性對照等方法減少和識別污染微生物。

3.2微生物種類與結果判讀 mNGS檢測具有無偏向性和超靈敏性的特點，即使針對無菌部位的標本，一次檢測也可以匹配到多種微生物的序列。需要根據檢測的微生物種類、序列數(reads)、參考疑似背景微生物庫、陰性對照、臨床特征進行綜合判讀。

(1)檢出明確的致病菌，如MTB、諾卡菌、流感病毒、新冠病毒、曲霉、新型隱球菌等，即使序列數較低也可能是致病性病原體。(2)檢出條件致病菌，如銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、鏈球菌等，需要結合標本類型、序列數、微生物排名、動態變化及臨床診斷綜合判斷。(3)檢出常見呼吸道定植菌和皮膚定植菌，如草綠色鏈球菌、干燥奈瑟菌、白念珠菌、痤瘡丙酸桿菌，一般不考慮為致病微生物，除非序列數特別高，并與臨床癥狀吻合。(4)檢出罕見特殊病原體，如炭疽芽胞桿菌，當癥狀、體征與臨床認知不符時，可使用Sanger測序、PCR方法或結合抗原/抗體檢測進一步驗證。

3.3mNGS檢測序列數與結果判讀 序列數指匹配到該病原體的序列數目。序列數的多少與標本中病原體含量多少、病原體基因組大小、標本中核酸提取量呈正相關，而與標本中人源序列比例呈負相關。不同的病原體具有不同的序列數特點，要結合病原體的種類、序列數目、病原體排位等信息對每個病原體逐個分析，進行報告。

(1)一般細菌：mNGS檢測到某種細菌(種水平)的序列數是其余所有細菌的10倍以上，有臨床意義[40]。

(2)真菌：mNGS檢測到真菌(種水平)的序列數是其余所有真菌的5倍以上，有臨床意義[41-42]。

(3)MTB：為明確致病菌，環境污染的可能小。此外，因MTB為胞內致病菌，細胞外游離DNA少，且MTB核酸提取效率低，mNGS只要檢測到1條屬水平的MTB復合群序列，且能排除其他標本攜帶污染，就有臨床意義[43-44]。

(4)非結核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)：NTM可能是環境中污染菌，若檢出，需結合背景微生物庫和mNGS原始細菌列表進行結果判讀。若排除污染后屬水平或種水平序列數排名前十，則有臨床意義[45-46]。

4 存在的問題及展望

mNGS能無偏倚性檢測各種病原體，彌補了傳統病原學檢測方法的不足，在感染性疾病的診斷中顯示出巨大的臨床應用價值，已被多個指南和共識推薦[47-55]。目前，mNGS臨床應用仍面臨一些問題，需要不斷完善，如：標本的采集、核酸提取、基因文庫構建、試劑選擇、測序數據量和生物信息分析(參考數據庫和數據算法)等缺乏標準化，測序過程和測序結果沒有質控標準；標本前處理操作復雜繁瑣，涉及多次轉管和移液操作，費時較長，容易出現操作失誤和樣本污染；mNGS能檢測到某些耐藥基因和毒力基因，但由于測序深度不夠，尚不能檢測所有的耐藥和毒力基因，也不能確定檢出的耐藥基因/毒力基因與感染菌的相關性，存在較高的假陰性和假陽性；另外，檢測成本較高，外送檢測周轉時間(turn-around time,TAT)較長。且mNGS作為一種新型檢測方法，陽性結果僅代表臨床標本中檢出某病原體的核酸片段，無法確定該病原體與感染之間的關系，在有條件的情況下，還應用其他方法或者感染相關的標志物進行驗證。因此，mNGS尚不宜作為常規檢測技術，需要掌握適應癥。隨著測序技術的發展以及越來越多的醫院臨床實驗室自主開展mNGS檢測，建立規范化檢測流程和結果判讀標準已成為業內專家的共識。預計在未來5～10年內，mNGS操作將更加自動化，流程更加標準化，成本亦將顯著降低，有望成為感染性疾病病原學診斷的常規檢測技術。

致謝：感謝陳昊(杭州杰毅生物技術有限公司)和麻錦敏(深圳華大因源醫藥科技有限公司)對本文的建議和指導。