利用干牛糞制備復合載體吸附微生物的研究

武光宇，楊 萌，楊明月，魯 琳＊

1 北京農學院動物科學技術學院，北京 101300

2 農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京 102206

0 引言

固定化細胞技術是從20世紀70年代開始逐漸由固定化酶技術發展而來，利用物理或化學方法，使微生物細胞與固體的不溶性支持物，即載體相結合，從而可保持其方便儲存與運輸，又能保持其活性。 用此方法，酶無需從細胞被分離和純化，因此，酶的活性也只是輕微降低。微生物固定化技術因其細胞密度高、反應速度快、穩定性好、抗毒害能力強、微生物損失小、產品容易分離、污泥含量低而被廣泛應用于廢棄物處理[1～4]。該項技術可高濃度選擇性地固定各種優勢菌種，是近代工業微生物學上的重要革新，展示著廣闊的前景。

最常用的微生物固定化載體可分為三類：無機載體、有機聚合物載體和復合載體。復合載體是一種結合了無機載體和有機載體的新型載體，兩類材料的特性相互補充，體現了復合載體的優越性，有效地克服了生物固定化應用中遇到的問題，如形成的球粒容易碎裂和喪失活性，在降低成本和改善廢物管理方面有明顯的長處[5，6]。用作載體的硅藻土的主要成分是SiO2，已被證明可以穩定活性成分，而且這種作用隨著K2O和Na2O含量的增加而增加。當硅藻土被酸處理后，氧化物含量減少，SiO2含量增加，比表面積和孔隙體積增加，使經過處理的硅藻土成為比天然硅藻土更好的載體。

近年來，關于固定化生物催化劑的研究發展迅速[7]，并提出了一個基于共培養技術的新概念。共同培養方法通常使用具有相似培養條件的菌株，而這些菌株差異大，會使共同培養變得困難，但先以共同培養方法通過單獨培養菌株，然后將它們共固定起來的共固定技術克服了這些差異[8]。

本試驗選擇了不同比例的麥麩、鋸末、干牛糞和硅藻土制備復合載體，研究了復合載體對微生物的吸附效果，旨在固化微生物時有相對固定的方法可尋，節約時間，提高效率。

1 試驗材料與方法

1.1 復合載體的吸水量測定

在無菌條件下將菌液與各載體充分混勻，每次加入5 mL菌液，使載體濕潤，并保持疏松，不結塊。以菌劑所含的菌液量為載體吸水率，反映載體的吸附能力。

1.2 復合載體吸菌后的條件優化

1.2.1 菌劑制作

在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養液，將細菌ZX5、細菌ZH9、真菌ZZ9分別接種到發酵液體培養基中。

細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨5.00 g，氯化鈉5.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.2。

真菌的培養基為改良的高氏一號培養基：葡萄糖10.00 g，蛋白胨5.00 g，硝酸鉀1.00 g，氯化鈉0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 ml，pH值為7.2～7.4。在25 ℃下靜置培養至對數期。

1.2.2 載體制作

稱量三角瓶子重量m1，分別稱量復合載體，選擇不同比例的麥麩、鋸末、干牛糞和硅藻土制備復合載體A、B、C，配比見表2-1。大約100 g于三角瓶中，于0.1 MPa，滅菌20 min后，放于烘箱中，在60 ℃下烘干48 h直到恒重，稱重為m2，由此得到載體凈重。按載體的吸水率，分別向載體中加入相應菌液量，分別放入30 ℃、40 ℃、50 ℃下儲存（表2、3）。分別在其第1、3、15、30天測定其纖維素酶酶活、脲酶酶活及過氧化氫酶酶活。

表1 復合載體配比

表2 復合載體接種不同菌種的樣本標號

表3 復合載體接種不同菌種后在不同溫度下的樣本標號

1.2.3 酶活測定

（1）纖維素酶活性測定（硝基水楊酸比色法）

葡萄糖標準溶液（1 mL標準液含0.2～0.8 mg葡萄糖）繪制：分別取不同濃度標準溶液1 mL移入25 mL容量瓶中，加3 mL二硝基水楊酸溶液。將試管放在沸騰水浴上5 min，然后迅速冷卻3 min，定容。15 min后在分光光度計上于波長540 nm處比色測定。以光密度值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

操作步驟：稱1 g菌劑于50 mL三角瓶中，加20 mL 1%羧甲基纖維素溶液、5 mL pH值為5.5磷酸鹽緩沖液及1.5 mL甲苯，將三角瓶放在37 ℃恒溫箱中培養72 h。培養結束后，過濾并定容25 mL。取1 mL濾液，然后按照繪制標準曲線顯色法比色測定。纖維素酶活，以72 h，10 g土壤生成葡萄糖毫克數表示。

（2）脲酶活性測定

標準溶液的繪制：精確的稱量0.471 7 g硫酸銨在水中，稀釋到1 000 mL，進而獲得1 mL含有0.1 mg氮的標準溶液。該溶液可以再作稀釋處理，稀釋倍數為10。將1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、11 mL、13 mL稀釋后的標準溶液移入50 mL容量瓶中，并加入20 mL蒸餾水，繼續加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氨酸鈉溶液，邊加邊搖，使其充分混合，20 min后，溶液顏色穩定，定容。用分光光度計在578 nm處進行色譜分析，此操作在1 h內進行，以光密度值和溶液濃度為依據繪制標準曲線。

操作步驟：取1.00 g菌劑置于50 mL三角瓶中，加1 mL甲苯。15 min后加入10 mL10.0%尿素液和20 mLpH值為6.7的檸檬酸鹽緩沖液。搖勻后在37 ℃恒溫箱中培養24 h。過濾后取3 mL濾液注入50 mL容量瓶中，然后按繪制標準曲線顯色方法進行比色測定。脲酶活性以24 h后1.00 g土壤中NH3-N的毫克數表示。

（3）過氧化氫酶活性測定

取1.00 g菌劑置于100 mL三角瓶中，并注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫溶液。將三角瓶放在往復式振蕩機上，振蕩20 min。而后加入5 mL 的0.6 mol/L硫酸，以穩定未分解的過氧化氫，再將瓶懸液用慢速型濾紙過濾。然后，吸取25 mL濾液，和0.02 mol/L高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點。過氧化氫酶活性以20 min后1.00 g土壤的0.02 mol/L高錳酸鉀的毫升數表示。

2 試驗結果

根據單載體的優化試驗，選出幾個表現較好的載體：麥麩，鋸末，干牛糞和硅藻土。將這幾種載體按照一定比例配成復合載體，進行進一步的優化試驗。

2.1 復合載體的吸水率

復合載體的吸水率見表4。

表4 復合載體的吸水率

2.2 復合載體吸菌后的優化條件

從圖1可以看出， ZH9過氧化氫酶活性測定中，24號的表現最為突出，各樣本除23、24號在培養第30天左右出現峰值，其余普遍在培養第3天時出現峰值。而從其纖維素酶活性的測定（圖2）可以知道各樣本的酶活相差不大，但纖維素酶的活性隨著時間的增加而增大，在培養第15天的時候出現峰值。其脲酶活性普遍偏低（圖3），而且各樣本出現峰值的時間沒有規律可言，但考慮到固定化菌劑的儲存問題，只有24號在培養第30天左右出現峰值。由此可見，24號樣本為固定ZH9菌劑的最優條件。24號：復合載體B（麥麩25.0%，鋸末25.0%，干牛糞20.0%，硅藻土30.0%），儲存溫度：40 ℃。

圖1ZH9菌過氧化氫酶活性

圖2ZH9菌纖維素酶活性

圖3ZH9菌脲酶活性

圖4ZZ9過氧化氫酶活性

從圖4可以看出，ZZ9過氧化氫酶活性測定中，10、11、12號的表現均較為突出，但3 個樣本的過氧化氫酶活性出現峰值的時間卻有些差異，10號在培養到第30天左右出現峰值，而11、12號則是在培養到第15天左右出現峰值，且11號＞12號。而從其纖維素酶活性的測定（圖5）可以看出，各樣本的酶活相差不大，但纖維素酶的活性隨著時間的增加而增大，在培養第15天的時候出現峰值。其脲酶活性普遍偏低（圖6），而且各樣本出現峰值的時間大部分在培養第3天左右出現峰值，而10號樣本在各個階段的脲酶活性較其他樣本均偏高。綜上所述，10號樣本為固定ZZ9菌劑的最優條件。10號：復合載體A（麥麩50.0%，鋸末10.0%，干牛糞20.0%，硅藻土20.0%），儲存溫度：30 ℃。

從圖7可以看出，ZX5過氧化氫酶活性普遍較低，1、5號的表現均較為突出，但這兩者的過氧化氫酶活性出現峰值的時間卻有些差異，15號在培養到第15天左右出現峰值，而1號則是在培養到第1天左右出現峰值，而從其纖維素酶活性的測定（圖8）可以知道各樣本的酶活相差不大，但纖維素酶的活性隨著時間的增加而增大，在培養第15天的時候出現峰值，其脲酶活性普遍偏低（圖9），而且各樣本出現峰值的時間大部分在培養第3天左右出現峰值，而5號樣本在各個階段的脲酶活性較其他樣本普遍偏高。綜上所述，5號樣本為固定ZX5菌劑的最優條件。5號：復合載體C（麥麩35.0%，鋸末35.0%，干牛糞20.0%，硅藻土10.0%），儲存溫度：40 ℃。

圖5ZZ9菌纖維素酶活性

圖6ZZ9菌脲酶活性

圖7ZX5菌過氧化氫酶活性

圖8ZX5菌纖維素酶的活性

圖9ZX5菌脲酶的活性

3 結論

研究表明，細菌ZX5及ZH9的儲存溫度均在40 ℃時為最佳，但ZX5的最適復合載體為C，而ZH9的最適復合載體為B，復合載體C的麥麩、鋸末量均高于復合載體B，而硅藻土含量卻遠小于復合載體B，麥麩、鋸末的透氣性及養分含量要遠高于硅藻土，由此可見，ZX5對氧氣及養分的需求要高于ZH9；而真菌ZZ9的最適儲存溫度為30 ℃，最佳復合載體為A，其麥麩的含量占到50%，說明ZZ9對于養分需求較高。

綜上所述，即使使用相同的底物和載體單位數量，不同的固定化方法將導致細菌與載體結合的模式和水平不同，而且沒有適用于所有類型微生物的通用固定化方法。這意味著微生物細胞的固定化是具特異性的。