不同產區黃芩SSR分子標記鑒別研究△

劉美娟，鄭司浩，趙莎，秦義杰，曾燕，王繼永

中國中藥有限公司，北京 100195

黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 為唇形科黃芩屬多年生草本植物，是一種廣泛使用的大宗藥材，其以根入藥，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1-3]。黃芩產于河北、遼寧、吉林、內蒙古、山東、山西、陜西等地，不同產地黃芩藥材的藥效差異較大[4-5]。近年來，對黃芩的研究多集中在生理生化、藥理等方面[6-7]，不同種質鑒別多運用性狀鑒別及顯微鑒別等方法[8]，通常依賴于個人經驗及主觀判斷，技術可推廣性欠缺。黃芩產地的鑒別一直是黃芩物種鑒定的技術難點，也是當前中藥資源產業面臨的行業難題。

DNA 分子標記技術具有高效、準確、不受環境條件影響、實驗操作簡單等優點[9]，已廣泛應用于植物品種真實性鑒定及純度檢測研究[10-11]。簡單重復序列（SSR）標記是近年來發展起來的建立在聚合酶鏈式反應（PCR）基礎上的第二代分子標記。由于SSR 分子標記具有數量豐富、多態性高、遺傳共顯性、譜帶擴增穩定、精度高、檢測時間短、技術成熟等特點，已應用于作物遺傳學研究[12-13]。文苗苗等[14]對6 個野生或栽培產區共147 份黃芩種質進行遺傳多樣性分析和評價，分子聚類結果表明，不同產區黃芩種質間存在一定的遺傳分化和基因交流，遺傳變異主要存在于產區內。張紅瑞等[15]利用簡單序列重復區間擴增多態性（ISSR）分子標記技術分析得到，黃芩種源間的親緣關系與地理位置存在一定的聯系。本研究基于黃芩全基因組設計SSR 引物，鑒別河北、遼寧、吉林、內蒙古、山東、山西和陜西地區黃芩種質資源，以期為黃芩產區鑒定、資源的保護和開發及分子標記輔助育種等提供參考。

1 材料

黃芩樣本分別采于河北，遼寧、吉林（以下簡稱“東北”），內蒙古，山東，山西、陜西（以下簡稱“山陜”）地區共計5 個產區的黃芩各12、12、10、11、13 株，所采樣品均為當年萌發的鮮葉，樣品信息見表1。經中國中藥有限公司曾燕副研究員鑒定為黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi。

表1 黃芩樣品采集信息

T100 型PCR 儀、GelDocXR+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；DYY-6D 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；1-14 型離心機（德國Sartorius 公司）；NanoDrop One 型超微量分光光度計（美國Thermo公司）。

異丙醇（批號：20190605）、無水乙醇（批號：20190507）均購自國藥集團化學試劑有限公司；TaqDNA聚合酶（批號：W9205a）、10×TaqBuffer（批號：U8402a）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取

黃芩基因組DNA 利用改良的十六烷基三甲基溴化銨法（mCTAB）提取。取黃芩葉片樣品100 mg，浸入液氮冷凍研磨至細小的粉末；加入buffer A溶液1.5 mL，反復顛倒混勻，冰浴10 min，10 000×g離心2 min，棄上清液；加入buffer A 溶液1.5 mL，反復顛倒混勻，冰浴10 min，10 000×g離心2 min 后，棄上清液；加入預熱的2%CTAB溶液800 μL，沉淀均質懸浮后，65 ℃水浴1.5～2.0 h，其間顛倒均質溶液3～5次；10 000×g室溫離心5 min，取DNA上清液至2.0 mL離心管中，加入等體積CI（三氯甲烷-異戊醇24∶1）溶液，顛倒搖床上混合10 min；10 000×g離心5 min，取上清液至新的2.0 mL 離心管中，加入等體積CI溶液，顛倒搖床上混合10 min；10 000×g離心10 min，取上清液至新的1.5 mL 離心管中，加0.6倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混合后置于-20 ℃冰箱保存1 h以上；10 000×g離心2 min，棄上清液，控干液滴，加入RNase溶液（100 mg·L-1）100 μL，37 ℃保存0.5 h；依次加入雙蒸水（ddH2O）150 μL、5 mol·L-1NaCl 50 μL和無水乙醇700 μL，充分混合，10 000×g離心3 min，控干液滴，加入70%乙醇600 μL，混合后離心2 min，棄上清液；加入70%乙醇600 μL，混合后離心2 min，棄上清液；加TE 緩沖液100 μL溶解DNA，并根據超微分光光度計測定將樣品DNA稀釋至50 ng·μL-1，用于后續的PCR擴增。

2.2 SSR引物篩選

基于文獻研究篩選SSR 引物[16]：在SSR 核心區側翼序列中（150 bp 范圍），使用primer 3 進行primer 引物設計。引物最佳長度為24 bp；引物最小長度為20 bp；引物最大長度為28 bp；最佳退火溫度為58 ℃；最低退火溫度為55 ℃；最高退火溫度為60 ℃；1 對引物退火溫度的最大差值為1 ℃。其他參數采用primer 3 的默認參數。將得到的引物BLAST 比對回基因組上，將成對引物在基因組上可以擴增得到的序列長度進行比較，與含有目標SSR的產物長度差在2 kb 以上，保留該對引物，與含SSR 產物長度差在2 kb 以內的，濾掉該引物，最終得到59 233對SSR引物。選擇重復單元堿基數2～5 bp，重復單元5～10次的50對SSR引物進行預實驗，所選擇的引物長度為20～25 bp，理論退火溫度為55～60 ℃，PCR產物長度為150～350 bp。

2.3 PCR擴增及檢驗

用篩選出的引物對提取的5 個不同產區所有黃芩DNA 樣本進行PCR 反應。反應體系為ddH2O 11.8 μL、10×TaqBuffer 2 μL、2 mmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2 μL、5 μmol·L-1正向引物（forward primer）1 μL、5 μmol·L-1反 向 引 物（reverse primer）1 μL、TaqDNA 聚合酶（TaqDNA polymerase）0.2 μL、50 ng·μL-1的DNA 模板2 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性0.5 min，退火0.5 min（引物Sb2、Sb5、Sb13、Sb21、Sb23、Sb26、Sb28 退火溫度為55 ℃，引物Sb16、Sb22退火溫度為54 ℃），72 ℃延伸1 min，32 個循環；72 ℃延伸10 min。

分別取PCR 擴增產物2 μL，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓160 V，時間15 min，通過凝膠成像系統觀察否有條帶且片段大小是否合適以確認實驗成功。將檢驗成功的PCR 擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行毛細管電泳測序分型，得到PCR擴增產物的分型結果。

2.4 數據分析

PCR 擴增產物分型結果用GeneMarker 4.0 進行峰圖判讀[17]。記錄等位基因片段大小，得到等位基因矩陣，具體是以“0，1”二元方式來記錄等位基因片段大小，即某個等位基因存在時記為1，某個等位基因不存在時記0，缺失數據記為-9，從而得到等位基因矩陣。根據上述等位基因矩陣，通過GenALEx 計算黃芩在每個產區間、每個個體間的遺傳多樣性數據及遺傳距離。基于GenALEx 計算所得的個體遺傳距離矩陣，通過分子進化遺傳分析（MEGA）進行非加權組平均法（UPGMA）聚類分析，構建聚類樹。

3 結果與分析

3.1 引物篩選

SSR 是共顯性標記，同一引物擴增不同產區黃芩，擴增產物牽引率相同的條帶被認為是有同源性[18]。從擴增成功率以及多態性（毛細管熒光電泳方式）2個維度進行引物的選擇，最終選定9對多態性好、擴增成功率高的SSR 引物。篩選引物信息見表2，其中Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26 引物對東北地區黃芩擴增成功率高；Sb21、Sb22、Sb28 引物對內蒙古地區黃芩擴增成功率高；Sb5、Sb13、Sb16、Sb22引物對山陜地區黃芩擴增成功率高。

表2 黃芩DNA樣品PCR擴增篩選引物信息

3.2 不同產區黃芩遺傳多樣性分析

3.2.1 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26 的遺傳多樣性分析 多態性位點是衡量遺傳多樣性的重要參數。基于黃芩SSR 引物組合（Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26）對5 個產區黃芩遺傳多樣性進行分析，見表3。結果顯示，5 個產區黃芩樣品的觀測等位基因數（Na）為3.200～4.600，有效等位基因數（Ne）為2.704～3.189，Shannon′s 指數（I）普遍較高，為0.994～1.197，其中東北產區的Ne均值相對最低，相應的I也較低。同時山陜產區的樣品觀測雜合度（Ho）<期望雜合度（He），表明該產區可能存在一定的近交現象或者有雜合缺失未檢測到的情況。

表3 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的黃芩遺傳多樣性分析

3.2.2 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的遺傳多樣性分析 基于黃芩SSR 引物組合（Sb21、Sb22、Sb28）對5 個產區黃芩遺傳多樣性進行分析，見表4。5 個產區黃芩樣品的Ne為1.592～4.091，I除了內蒙古產區外普遍較高，為0.545～1.461，其中內蒙古產區的Ne均值最低，相應的I也較低。河北、內蒙古、山東產區樣品的Ho>He，表明該產區可能存在一定的雜種選擇現象或者遠交現象；東北產區與山陜產區樣品的Ho

表4 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的黃芩遺傳多樣性分析

3.2.3 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22 的遺傳多樣性分析 基于黃芩SSR 引物組合（Sb5、Sb13、Sb16、Sb22）對5 個產區黃芩遺傳多樣性進行分析，見表5。5個產區黃芩樣品的Ne為2.809～4.209，I普遍較高，為1.127～1.537，其中山陜產區的黃芩樣品Ne均值最低，相應的I也較低。河北產區的樣品Ho

表5 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的黃芩遺傳多樣性分析

3.3 聚類結果分析

3.3.1 東北產區黃芩鑒定 基于黃芩SSR引物組合（Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26），通過GenALEx計算各產區黃芩樣品的遺傳距離（表6）。各產區樣品間平均遺傳距離為0.296，其中東北與山東產區樣品的遺傳距離最大，為0.497，說明2 個產區黃芩種群關系最遠；山東與河北產區樣品的遺傳距離最小，為0.192，說明2 個產區黃芩種群關系最近。通過MEGA進行UPGMA聚類分析，構建聚類樹（圖1）。黃芩樣品聚為5 個分支，只有東北產區的聚為較純的1 個分支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時也說明5 對SSR 引物可以較好地對產地為遼寧和吉林的黃芩樣品進行區分鑒定。

表6 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的各產區黃芩樣品遺傳距離

圖1 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的不同產區黃芩遺傳聚類

3.3.2 內蒙古產區黃芩鑒定 基于黃芩SSR引物組合（Sb21、Sb22、Sb28），通過GenALEx 計算各產區黃芩樣品的遺傳距離（表7）。各產區樣品間平均遺傳距離為0.255，其中山陜與內蒙古產區樣品的遺傳距離最大，為0.412，說明2 個產區黃芩的種群關系最遠；山東與河北、山陜產區樣品的遺傳距離相對最小，分別為0.099、0.083，說明山東與河北、山陜產區黃芩種群關系相對更近。通過MEGA進行UPGMA 聚類分析，構建聚類樹（圖2）。只有內蒙古產區的黃芩樣品聚為較純的1 支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時也說明3 對SSR 引物可以較好地對產地為內蒙古的黃芩進行區分鑒定。

表7 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的各產區黃芩樣品遺傳距離

3.3.3 山陜產區黃芩鑒定 基于黃芩SSR引物組合（Sb5、Sb13、Sb16、Sb22），通過GenALEx 計算各產區黃芩樣品的遺傳距離（表8）。各產區樣品間平均遺傳距離為0.356，其中山陜與東北產區樣品的遺傳距離最大，為0.565，說明2 個產區黃芩的種群關系最遠；產區河北與產區內蒙古、東北的遺傳距離相對最小，分別為0.109、0.196，說明產區河北與產區東北、內蒙古的種群關系相對更近。基于GenALEx 計算所得的遺傳多樣性數據中的遺傳距離，通過MEGA 進行UPGMA 聚類分析，構建聚類樹，如圖3 所示。只有山陜產區的聚為較純的一支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時也說明4對SSR 引物可以較好地對山西、陜西產區的黃芩進行區分鑒定。根據4對SSR引物多態位點結果，基于遺傳距離，若待鑒別黃芩與山陜產區聚在一起則表示該黃芩產地為山西或陜西。

表8 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的各產區黃芩樣品遺傳距離

圖3 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的不同產區黃芩遺傳聚類

4 討論

SSR 分子標記在親緣關系鑒定、遺傳進化關系、指紋圖譜、育種等領域應用十分廣泛[19-23]。因此，可以利用分子標記方法區分不同產區黃芩資源，并鑒定黃芩親緣關系。本研究利用SSR分子標記的方法，篩選出9 對引物，針對河北、東北（遼寧、吉林）、內蒙古、山東、山陜（山西和陜西）地區共計5 個產區的黃芩進行遺傳多樣性分析。結果表明，不同產地的黃芩具有豐富的遺傳多樣性，這與齊琳潔等[24]研究結果一致，為黃芩種質資源評價與利用提供了依據。張紅瑞等[15]采用ISSR 分子標記對54個黃芩種源進行分析。聚類分析圖自然聚為3 類，且地域相近的種源首先聚為一類，也存在陜西佳縣種源和遼寧建昌種源聚為一類，但不同的標記得到的結果可能有差異。本研究對不同產區黃芩進行SSR 分子標記鑒別，得到3 個引物組合用于鑒別東北、內蒙古、山陜產區的黃芩。而河北和山東產區的黃芩種質由于混雜較為嚴重，目前無法根據產地將其區分開，這一研究結果與文苗苗等[14]的研究結果一致。本研究結果可為黃芩優勢種植資源收集、保存與評價提供參考。