甘草地上部分寡糖富集純化及其抗衰老活性研究△

于冰莉，方永晟，龐昕昕，郭小趁，王文全，2*，劉永剛*

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；

2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

人口老齡化已成為人們最關注的全球性社會問題之一，衰老及衰老相關疾病成為日益嚴重的醫(yī)學問題和社會難題。氧化應激與衰老具有十分緊密的聯(lián)系。關于衰老的經(jīng)典學說氧化應激學說認為，衰老的根本原因是氧化性損傷，即自由基積累造成的細胞損傷[1]。通過抗氧化活性藥物降低體內(nèi)自由基水平是延緩機體衰老的重要途徑之一。

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖[2]，具有補脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效[3]。我國有“十方九草”“無草不成方”之說，從古至今，甘草根及根莖廣為藥用，而其地上部分常作為牧草或是焚燒丟棄，造成資源浪費。研究發(fā)現(xiàn)，甘草地上部分提取物具有抗氧化[4-9]、抗炎[9-10]、抑菌[11-14]、抗腫瘤[15]等多種藥理活性。甘草地上部分水提物中多糖類成分已有報道，且抗氧化活性良好[6]。從中藥提取出的寡糖活性成分有很多，如巴戟天寡糖可能通過抗氧化減輕子宮缺血再灌注損傷[16]；人參花寡糖可恢復D-半乳糖誘導的氧化損傷，提高氧化酶活力，減少丙二醛（MDA）在體內(nèi)的積累[17]。而甘草地上部分寡糖的研究尚未見相關報道。

本研究對甘草地上部分進行提取，運用柱色譜技術分離純化水提物得到寡糖類成分，借助凝膠滲透色譜、薄層色譜手段對其進行表征，通過體內(nèi)、體外實驗評價甘草地上部分寡糖的抗衰老、抗氧化活性，探索其中潛在抗衰老天然活性物質(zhì)，為后續(xù)甘草地上部分資源綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 菌株、線蟲品系

大腸桿菌Escherichia coliOP50、野生型秀麗隱桿線蟲株N2由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所惠贈。

1.2 試藥

甘草地上部分，2018 年9 月采集于甘肅省酒泉市瓜州縣河東鄉(xiāng)，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的地上部分，陰干，粉碎，備用。

無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯均為分析純（天津市致遠化學試劑有限公司）；吡啶、苯胺、磷酸、丙酮、硫酸、二苯胺、硝酸鈉、氯化鈉均為分析純（北京化工廠）；5%苯酚水溶液（上海源葉生物科技有限公司）；對照品D-葡萄糖（純度≥99%，批號：S21J12I138537）、D-果糖（純度≥99%，批號：J31M9R62568）、維生素C（純度≥98%，批號：S19J6G1），均購自上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[DPPH，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；葡聚糖相對分子質(zhì)量標準物質(zhì)[重均相對分子質(zhì)量（Mw）分別為289 000、110 000、60 600、12 600、4320，批號分別為C10025642、C10025640、C10034456、C10020386、C10020398]，購自上海麥克林生化科技有限公司；AB-8 型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；DEAE-52 型纖維素樹脂（北京索萊寶科技有限公司）；Sephadex LH-20型樹脂[安瑪西亞（中國）有限公司]；薄層色譜硅膠G板（青島海洋化工有限公司）。

1.3 儀器

CP224C型萬分之一分析天平（奧豪斯上海儀器有限公司）；Multiskan FC 型酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；BKQP-75L 型立式高壓滅菌鍋（濟南博鑫生物技術有限公司）；UV-2600 型紫外-可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；SMZ745 型體視顯微鏡、ECLIPSE Ts2R 型熒光倒置顯微鏡（尼康映像儀器銷售中國有限公司）；e2695型色譜儀[色譜柱為Ultrahydrogel TM 250（300 mm×7.8 mm，6 μm）與Ultrahydrogel TM Linear（300 mm×7.8 mm，10 μm）串聯(lián)]、2424 RI Detector型示差折光檢測器均購于沃特世科技有限公司。

2 方法

2.1 苯酚-硫酸法測總糖含量

2.1.1 葡萄糖標準曲線繪制 精密稱取對照品D-葡萄糖10 mg，加去離子水定容于100 mL量瓶中，混勻，即得葡萄糖對照品溶液，質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1。精密移取葡萄糖對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于10 mL 量瓶中，加入去離子水補至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，加入濃硫酸5 mL，振搖混勻，室溫條件下靜置20 min，冰浴15 min，在波長487 nm 處測定其吸光度（A）值。以A為縱坐標，對照品溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程。

2.1.2 樣品溶液總糖含量測定 精密稱取受試樣品10 mg，用去離子水定容于10 mL 量瓶中，混勻。精密移取樣品溶液0.1 mL 于10 mL 量瓶中，加入去離子水補至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，再加入濃硫酸5 mL，振搖混勻，室溫條件下靜置20 min，冰浴15 min，在波長487 nm處測定其A值，將A值代入回歸方程計算得到其總糖含量。

2.2 甘草地上部分寡糖的制備

取甘草地上部分，加10 倍量去離子水，加熱提取2 次，每次連續(xù)回流2 h，紗布濾過，合并濾液，旋蒸濃縮，真空干燥后得到水提物。

取水提物，溶于少量水中，過AB-8型大孔樹脂柱[18]，徑高比1∶8，吸附過夜，先以4 倍柱體積（BV）水洗除雜，再以30%乙醇洗脫，洗脫流速為3 BV·h-1，洗脫體積為8 BV，得到粗糖富集物。

取粗糖富集物，上樣DEAE-52 纖維素柱[19]，依次以去離子水及0.1、0.3、0.5 mol·L-1NaCl梯度洗脫，洗脫體積為4 BV，流速為1 mL·min-1，洗脫液每5 mL接1瓶，以洗脫體積為橫坐標，以苯酚-硫酸法測得總糖含量為縱坐標，繪制洗脫曲線，合并糖含量高的洗脫液，透析、濃縮、干燥，得到粗糖。

取粗糖，溶于少量甲醇中，上樣Sephadex LH-20 凝膠柱[20]，甲醇洗脫，洗脫體積為5 BV，流速為1 mL·min-1，洗脫液每5 mL 接1 瓶，以洗脫體積為橫坐標，以苯酚-硫酸法測得總糖含量為縱坐標，繪制洗脫曲線，合并糖含量高的洗脫組分，回收溶劑，得到甘草地上部分寡糖樣品。

2.3 甘草地上部分寡糖的表征

2.3.1 凝膠滲透色譜法測定樣品Mw標準曲線的制作：精密稱取Mw為289 000、110 000、60 600、12 600、4320 的葡聚糖對照品，配制成1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm 的濾膜濾過除雜后進樣。分析軟件為Angilent GFC；檢測流動相為0.1 mol·L-1硝酸鈉溶液，流速為0.6 mL·min-1，柱溫箱溫度為35 ℃，示差檢測器溫度為40 ℃，進樣量為20 μL，時間為45 min。

甘草地上部分寡糖測定：精密稱量甘草地上部分寡糖樣品，溶于去離子水中，配制成1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm 的濾膜濾過除雜后進樣。用Angilent GFC軟件分析計算樣品Mw。

2.3.2 薄層色譜法鑒定樣品成分 精密稱量甘草地上部分寡糖樣品10 mg，溶于去離子水10 mL中，配制成1 mg·mL-1的供試品溶液。精密稱量對照品D-葡萄糖和D-果糖各2 mg，溶于去離子水10 mL 中，配制成0.2 mg·mL-1的對照品溶液。展開劑為乙酸乙酯-乙醇-吡啶-水（8∶2∶2∶1）。點樣量為5 μL。顯色劑為苯胺-二苯胺溶液（取苯胺1 mL和二苯胺1 g，同溶于100 mL 丙酮中，再加85%磷酸水10 mL，混勻，棕色瓶保存，現(xiàn)用現(xiàn)配），85 ℃加熱10 min。

2.4 甘草地上部分寡糖體外抗氧化活性評價

精確稱取DPPH 5 mg，用無水乙醇溶解并定容于50 mL 量瓶中，質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1，避光保存。取96 孔板，加入不同質(zhì)量濃度（0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg·mL-1）的甘草地上部分寡糖樣品水溶液100 μL，再分別加入新配制的DPPH 溶液100 μL，避光反應30 min 后，用酶標儀在517 nm 波長下測定其A值。分別以去離子水和維生素C作為空白和陽性對照，每個質(zhì)量濃度重復4次。按照公式（1）計算自由基清除率。

自由基清除率=[1-(Ai-Aj)]/A0× 100%（1）

式中，Ai為DPPH 100 μL 和樣品溶液100 μL 混合液的吸光度；Aj為樣品溶液100 μL 和水100 μL 混合液的吸光度；A0為DPPH 100 μL 和水100 μL 混合液的吸光度。

2.5 甘草地上部分寡糖體內(nèi)抗衰老活性評價

2.5.1 溶液配制 M9 緩沖液、NGM 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、線蟲裂解液按照常規(guī)方法配制[21]。

2.5.2 線蟲同步化 N2 線蟲飼養(yǎng)于涂布有大腸桿菌E.coliOP50 的線蟲標準培養(yǎng)基NGM 中，20 ℃下培養(yǎng)。挑取50 只左右產(chǎn)卵期成蟲至1.5 mL 離心管中，加入線蟲裂解液1 mL。渦旋混勻3～5 min，3000 r·min-1離心3 min（離心半徑120 mm）；棄上清液至剩余液體0.1 mL，加入M9 Buffer 1 mL 混勻；重復此步驟2 次，最后保留液體0.1 mL，將液體滴加至新的線蟲生長培養(yǎng)基（NGM）中，次日孵化出新的線蟲。

2.5.3 氧化應激實驗 將經(jīng)過同步化生長至L4 期后的N2 線蟲置于含或不含藥物的NGM 中，實驗分對照組和甘草地上部分寡糖給藥組（質(zhì)量濃度分別為10、20、40 μg·mL-1），每板30 條，48 h 后，把各組線蟲轉(zhuǎn)移到含有0.4% H2O2的線蟲NGM 中觀察，每0.5 h 記錄線蟲存活數(shù)目，直至線蟲全部死亡，重復3次。

2.5.4 熱應激實驗 N2線蟲分組同2.5.3項下。給藥組線蟲經(jīng)不同質(zhì)量濃度的甘草地上部分寡糖處理48 h 后與對照組線蟲同時置于37 ℃培養(yǎng)箱中進行觀察，每2 h 觀察線蟲死亡情況，記錄并挑出死亡個體，直至線蟲全部死亡，重復3次。

2.5.5 壽命實驗 N2線蟲分組同2.5.3項下，每組50條，給藥后每48 h觀察1次線蟲的生存狀態(tài)，記錄死亡線蟲數(shù)量并將其挑出，并更換新的含藥或不含藥NGM，直至所有線蟲全部死亡，實驗重復3 次。采用Kaplan-Meier 生存分析不同質(zhì)量濃度組線蟲的存活率差異。

2.5.6 脂褐素含量測定 N2 線蟲分組同2.5.3 項下，給藥處理5 d后，挑至滴加M9 1滴的2%瓊脂片上，再滴加疊氮化鈉溶液1 滴，待蟲體變直，蓋上蓋玻片，于倒置熒光顯微鏡下觀察不同組線蟲體內(nèi)的脂褐素水平，固定曝光時間和強度，拍攝熒光圖片，拍攝條件為Ex 385 nm、Em 430 nm，使用Image J軟件統(tǒng)計圖片中脂褐素自發(fā)熒光強度。

3 結(jié)果

3.1 樣品Mw測定及薄層色譜鑒別

建立葡萄糖標準曲線為A=8.526 8C-0.045 6（r=0.996 9），葡萄糖質(zhì)量濃度為0.01～0.07 mg·mL-1有較好的線性關系。從甘草地上部分4 kg 中得到寡糖樣品410 mg，苯酚-硫酸法測其總糖質(zhì)量分數(shù)為81.23%。

采用高效凝膠滲透色譜法測定已知相對分子質(zhì)量的葡聚糖，記錄色譜峰保留時間，結(jié)果見圖1。建立葡聚糖標準曲線：Y=-3.464 6X+41.284（r=0.992 7），X為lgMw，Y為洗脫時間。取Mw為289 000的葡聚糖標準溶液重復進樣6 次，按上述色譜條件測定，葡聚糖標準溶液出峰時間的RSD為0.040 6%，說明該儀器精密度良好。取供試品溶液6 份，進樣，按上述色譜條件測定，溶液出峰時間的RSD 為0.081 5%，說明該方法重復性良好。取供試品溶液6 份分別放置0、1、2、4、8、10 h，進樣，按上述色譜條件測定，溶液出峰時間的RSD 為0.112%，說明樣品穩(wěn)定性良好。將樣品配制成1 mg·mL-1的供試品溶液，通過高效凝膠滲透色譜法測定，結(jié)果見圖2。樣品的圖譜不是對稱的色譜峰，左側(cè)可見多個肩峰，說明樣品中含有多種糖類組分，將樣品的洗脫時間最小肩峰值30 min 和峰值33.517 min 分別代入到回歸方程，計算得到樣品Mw為180～1800，判斷為寡糖類成分。

圖1 葡聚糖對照品的凝膠滲透色譜圖

圖2 甘草地上部分寡糖樣品的凝膠滲透色譜圖

以D-葡萄糖和D-果糖為對照品，采用薄層色譜法對樣品進行分析，結(jié)果見圖3。圖3顯示，樣品中不含葡萄糖和果糖。

圖3 D-葡萄糖、D-果糖、樣品的薄層色譜圖

3.2 甘草地上部分寡糖體外抗氧化活性評價

甘草地上部分寡糖樣品清除DPPH 自由基能力測定結(jié)果見圖4，不同質(zhì)量濃度樣品溶液對DPPH 自由基均有清除作用，并且在實驗選取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關系。樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.220 2 mg·mL-1，抗氧化活性弱于陽性對照維生素C（0.016 9 mg·mL-1）。表明甘草地上部分寡糖樣品具有一定的抗氧化活性。

圖4 甘草地上部分寡糖樣品與維生素C清除DPPH自由基的作用

3.3 甘草地上部分寡糖體內(nèi)抗氧化應激及熱應激活性評價

各組線蟲在H2O2應激環(huán)境中培養(yǎng)的生存曲線見圖5。與對照組比較，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲生存曲線均明顯右移。在氧化應激條件下，各質(zhì)量濃度樣品組線蟲存活率明顯提高，與對照組比較，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲存活率差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1對線蟲壽命延長作用最強，抗氧化應激能力最強。

圖5 氧化應激下甘草地上部分寡糖對線蟲壽命的影響

線蟲在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)的生存曲線見圖6。與對照組比較，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲生存曲線均明顯右移。在熱應激條件下各質(zhì)量濃度樣品組線蟲存活率均明顯提高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1組線蟲壽命延長作用最強，抗熱應激能力最強。

圖6 熱應激下甘草地上部分寡糖對線蟲壽命的影響

3.4 甘草地上部分寡糖對延緩線蟲衰老的影響

如圖7和表1所示，甘草地上部分寡糖各質(zhì)量濃度組線蟲生存曲線與對照組比較沒有發(fā)生明顯的偏移。甘草地上部分寡糖20、40 μg·mL-1組線蟲平均壽命均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1組線蟲最長壽命高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。說明甘草地上部分寡糖對線蟲壽命沒有顯著的延長作用。

表1 甘草地上部分寡糖對線蟲壽命的影響（,n=150）

表1 甘草地上部分寡糖對線蟲壽命的影響（,n=150）

圖7 甘草地上部分寡糖對線蟲壽命的影響

在熒光顯微鏡下可見線蟲體內(nèi)脂褐素自發(fā)藍色熒光。隨著線蟲壽命的增加，脂褐素含量逐漸增多。給藥5 d后，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲體內(nèi)脂褐素熒光強度均明顯降低，較對照組分別降低了23.8%、33.8%、23.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1組線蟲體內(nèi)脂褐素熒光強度最低，對線蟲體內(nèi)脂褐素沉積減緩作用最強，見圖8～9。

圖8 給藥5 d后各組線蟲體內(nèi)脂褐素熒光圖（40×）

4 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，甘草主要的抗氧化活性成分為黃酮類，包括甘草總黃酮[22]、查耳酮[23]、甘草苷[24]、異甘草素[25]等，同時甘草中三萜[26]和多糖[27-29]等成分也有一定的抗氧化作用。甘草水提液對具有細胞損傷作用的超氧陰離子自由基和羥基自由基均有明顯的清除作用，并能抑制羥基自由基誘發(fā)的膜脂質(zhì)反應，發(fā)揮一定的抗衰老作用[30]。甘草苷可以改善D-半乳糖所致衰老大鼠的學習記憶能力，減緩衰老引起的氧化損傷，提高腦內(nèi)的抗氧化能力[31]。甘草水提物對D-半乳糖致衰老的大鼠具有肝保護、抗氧化和抗衰老作用[32]。

中藥多糖來源廣泛，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)血脂、降血糖等多種生物活性，尤其在抗衰老方面有明顯的優(yōu)勢，其抗衰老作用機制一直是中藥多糖生物活性研究中的熱點之一。當歸多糖[33]、枸杞多糖[34]、肉蓯蓉多糖[35]、海帶多糖[36]、黃芪多糖[37]、鎖陽多糖[38]、黃精多糖[39]、平貝母多糖[40]、女貞子多糖[41]、馬齒莧多糖[42]等中藥多糖均可通過抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基，調(diào)節(jié)端粒酶活性和機體的糖、脂質(zhì)代謝，以及神經(jīng)-內(nèi)分泌功能等多種途徑來發(fā)揮抗衰老作用。殼寡糖作為殼聚糖降解后的衍生物，能有效清除羥基自由基和超氧陰離子自由基，具有較強的抗氧化活性[43]。系列褐藻膠寡糖通過清除活性氧自由基，來發(fā)揮抗氧化作用[44]。瓊膠寡糖具有較強且廣泛的抗氧化能力，對DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均存在較強的清除作用[45]。

本研究通過提取甘草地上部分，得到的水提物經(jīng)過AB-8 型大孔吸附樹脂、DEAE-52 纖維素、Sephadex LH-20 樹脂等柱色譜進行富集純化，得到甘草地上部分寡糖，質(zhì)量分數(shù)為81.23%，說明該方法可以有效去除水提物中的蛋白質(zhì)和色素，適宜于甘草地上部分寡糖的純化。經(jīng)凝膠滲透色譜法檢測，樣品Mw為180～1800，且薄層色譜鑒別顯示樣品不含葡萄糖和果糖，可判斷樣品為甘草地上部分寡糖類成分。其單糖組成及分子結(jié)構信息尚待進一步研究。樣品對DPPH 自由基有較好的清除作用，能顯著延長氧化應激、熱應激下線蟲壽命，減少線蟲體內(nèi)脂褐素沉積，具有良好的抗氧化損傷及抗衰老活性。說明甘草地上部分寡糖對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷和衰老具有一定的保護作用，在抗衰老方面具有一定的潛在藥用價值，但其作用機制有待深入研究。本研究為甘草地上部分寡糖在抗氧化、抗衰老方面的進一步研究及相關食品、藥品、保健食品等產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)，為天然產(chǎn)物的體外抗氧化、體內(nèi)抗衰老活性評價的探究提供了一定的方法指導。

圖9 給藥5 d后甘草地上部分寡糖對線蟲脂褐素沉積的影響（,n=30）