燈盞細辛中吡咯里西啶生物堿的含量分析及其肝毒性風險評估△

昝珂，周穎，李耀磊，左甜甜，金紅宇，王瑩*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；

2.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052

短葶飛蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.為菊科飛蓬屬植物，在我國分布于湖南、廣西、貴州、四川、云南及西藏等省區，其干燥全草作為燈盞細辛藥材使用，具有活血通絡止痛、祛風散寒的功效，用于頭痛、牙痛、風濕痹痛等疾病的治療[1-2]。燈盞生脈膠囊、燈盞花素片、燈盞細辛注射液等中成藥使用燈盞細辛作為主要藥材原料制成。燈盞細辛主要含有黃酮類、咖啡?？鼘幩犷悺]發油類等成分[3-6]。近年來研究表明，燈盞細辛中含有痕量的吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）[7]。PAs在菊科植物中較為常見，其母核的1，2位如為不飽和雙鍵則具有肝毒性，過量或長期攝入可導致肝損傷，甚至肝癌等嚴重疾病[10]。燈盞細辛中PAs 為痕量水平，一般需使用固相萃取法（solid phase extraction，SPE）富集凈化后進行檢測。印美定、石松胺、印美定-N-氧化物和石松胺-N-氧化物（圖1）是燈盞細辛中4 個主要的PAs，均具有肝毒性[11]。超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）具有較高的靈敏度，常用于藥材中PAs 類成分的測定[12-14]。本研究采用該方法建立燈盞細辛中4 個PAs（印美定、石松胺、印美定-N-氧化物和石松胺-N-氧化物）的含量，并根據測定結果進行初步的風險評估。

圖1 燈盞細辛中4個吡咯里西啶生物堿成分結構

1 材料

Acquity H-CLASS 型超高效液相色譜儀串聯Xevo TQ-S 型三重四極桿質譜（美國沃特世公司）；S300H 型超聲波清洗器（德國ELMA 公司）；SECURA225-1CN型電子天平（德國Sartorius公司）。

對照品印美定（批號：82424，純度：99.07%）、石松胺（批號：89726，純度：99.11%）、印美定-N-氧化物（批號：13418，純度：100.00%）和石松胺-N-氧化物（批號：83447，純度：96.75%）均購于德國PhytoLab GmbH 公司；甲醇、乙腈、甲酸和甲酸銨均為MS 級（美國費希爾公司）；Milli-Q 超純水（美國密理博公司）。

燈盞細辛8 批藥材，分別于湖南省常德市，貴州省黔南布依族苗族自治州、貴陽市，廣西壯族自治區玉林市、柳州市，四川省成都市，云南省大理白族自治州、麗江市等地采集（編號為S1～S8），經中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所昝珂副研究員鑒定為菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.的干燥全草，見表1。

表1 燈盞細辛樣品信息

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液制備 精密稱取印美定、石松胺、印美定-N-氧化物和石松胺-N-氧化物對照品適量，分別加入10%乙腈水溶液制備成質量濃度分別為1.012、0.992、1.024、1.004 μg·mL-1的混合對照品母液。精密量取混合對照品母液1.0 mL置于同一100 mL量瓶中，加入10%乙腈水溶液至刻度，即得質量濃度分別為10.12、9.92、10.24、10.04 ng·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取燈盞細辛粉末（過四號篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol·L-1硫酸水溶液20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質量，用0.05 mol·L-1硫酸水溶液補足減失的質量，搖勻，用定量濾紙濾過，取續濾液進行SPE 萃取。SPE 柱先分別用甲醇5 mL 和0.05 mol·L-1硫酸水溶液5 mL 洗脫，取上述續濾液10 mL 上樣。待吸附后，先用甲醇10 mL 洗去雜質，再用8%氨水-甲醇溶液10 mL 洗脫，收集該流分，回收溶劑至1 mL 左右，用10%乙腈轉移至10 mL 量瓶中并定容至刻度，用0.22 μm 有機濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜-質譜條件

色譜柱：WATERSAcquityUPLCHSST3（100mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），水相和有機相中各按1%加入甲酸-甲酸銨緩沖液（5%甲酸和0.25 mol·L-1甲酸銨水溶液）；梯度洗脫（0～8 min，3%～10%B；8～20 min，10%B）；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；電噴霧離子源（ESI+）；毛細管電壓：3.0 kV，脫溶劑溫度：500 ℃；離子源溫度：150 ℃；質譜掃描采用多反應監測模式（MRM）；其他質譜測定條件見表2，提取離子流圖見圖2。

圖2 對照品溶液和燈盞細辛樣品的MRM離子流色譜圖

表2 燈盞細辛中4個吡咯里西啶生物堿成分的質譜測定條件

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系及檢測下限、定量下限考察 精密吸取2.1.1 項下混合對照品母液用10%乙腈水溶液按10、20、50、100、200、1000 倍進行稀釋，制得6個質量濃度的系列混合對照品溶液，按照2.2項下色譜-質譜條件測定。以峰面積為縱坐標（Y），待測組分質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸方程和相關系數（r）。以信噪比（S/N）為3 計算待測組分的檢測下限，以S/N 為10計算待測組分的定量下限，結果見表3。

表3 燈盞細辛中4個吡咯里西啶生物堿成分測定的回歸方程、線性范圍、檢測下限和定量下限

2.3.2 精密度試驗 取2.1.1 項下的混合對照品溶液，按2.2項下色譜-質譜條件測定，連續進樣6次，記錄峰面積并計算RSD。4 個PAs 峰面積的RSD 分別為1.9%、2.1%、2.5%和2.6%。實驗結果表明儀器具有良好的精密度。

2.3.3 穩定性試驗 按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2 項下色譜-質譜條件測定，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，記錄峰面積并計算RSD。4 個PAs 峰面積的RSD 分別為1.8%、2.1%、2.3%和2.2%。實驗結果表明，供試品溶液穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取同一批次（S1）藥材樣品6 份，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2 項下色譜-質譜條件測定，計算化合物的質量分數。4 個PAs 的平均質量分數分別為20.42、9.82、41.08、19.90 μg·kg-1，RSD 分別為2.8%、2.9%、3.5%和3.7%。結果表明，實驗方法具有良好的重復性。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取2.3.4 項下已測得含量的燈盞細辛粉末6 份，每份各約1.0 g，分別近似1:1 加入各對照品，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2 項下色譜-質譜條件測定含量，計算回收率，4 個PAs 的平均加樣回收率分別為94.2%、90.6%、88.7%和92.8%，RSD分別為4.0%、3.7%、4.2%和3.9%。

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取不同產地的燈盞細辛樣品粉末，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2 項下色譜-質譜條件測定峰面積，采用外標法計算得到4 個PAs的含量結果，見表4。

表4 各批次燈盞細辛樣品中4個吡咯里西啶生物堿成分的質量分數（n=2）μg·kg-1

3 風險評估

燈盞細辛所測8 批樣品中4 個PAs 的總質量分數為91.18～231.03 μg·kg-1?！吨腥A人民共和國藥典》2020 年版一部燈盞細辛項下規定用量為9～15 g[1]，按此計算，每日攝入PAs 范圍為0.82～3.46 μg。目前國內尚無對該藥材中PAs 限值的規定。歐洲藥品管 理 局（European Medicines Agency，EMA）在2016 年規定每日攝入PAs 量應不超過0.35 μg[7,15]，8批燈盞細辛中PAs 的含量均超過EMA 每日攝入量的規定。

目前世界各國權威機構對肝毒性PAs 的風險評估均采用暴露限制（margin of exposure，MOE）計算得出。若MOE>10 000，健康風險較低；反之，風險應予以關注。根據文獻報道，采用公式（1）～（2）計算燈盞細辛中PAs的MOE[7]，結果見表5。

表5 燈盞細辛中4個吡咯里西啶生物堿成分風險評估結果

式中，EDI（estimated daily intake）為估計每日攝入量（μg·kg-1·d-1）；C為藥材中含有的PAs 總質量分數（μg·kg-1）；M為《中華人民共和國藥典》2020 年版規定的藥材最大使用劑量，燈盞細辛為15 g；BW 為人體體質量，按70 kg 計算；1000 為換算因子。BMDL10是PAs 的健康指導值，為237 μg·kg-1·d-1[13]。

8 批藥材的MOE 為4787～12 130；其中有6 批的MOE<10 000，如長期使用，存在一定的安全風險。按MOE最低值計算，如燈盞細辛每日攝入量低于7.2 g，則MOE>10 000，健康風險較低。

4 討論

本研究建立了UPLC-MS/MS 對燈盞細辛中4 個主要PAs 含量進行同步測定，經方法學考察符合要求。含量分析結果顯示，印美定、石松胺、印美定-N-氧化物和石松胺-N-氧化物在8 批次燈盞細辛中的質 量 分 數 分 別 為15.14～66.72、11.32～42.55、26.32～98.34、19.82～55.23 μg·kg-1。風 險評 估顯示，燈盞細辛存在一定的用藥安全風險，應盡量減少用藥量或縮短用藥周期。本研究測定的燈盞細辛樣品數量有限，不同批次樣品間PAs 含量存在一定差異，應進一步擴大采樣量及范圍，研究不同產地、不同采收月份燈盞細辛樣品中PAs 含量的規律，為燈盞細辛藥材的選用提供參考。