藤黃莖皮中莽吉柿素對人胃癌HGC-27細胞的作用研究△

常安琪，張云封，李軍，付冬君，宋月林

北京中醫藥大學 中藥學院 中藥現代研究中心，北京 100020

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人民的健康，2015 年我國胃癌發病率和病死率分別為0.029%和0.021%，病死率較高[1-2]。近年來，許多研究發現中藥具有一定的抗腫瘤作用，并且在中西醫結合治療腫瘤方面顯示出增效減毒的作用[3-4]。藤黃是藤黃科藤黃屬植物藤黃樹的樹脂，具有消腫攻毒、祛腐斂瘡之功效，現代藥理研究認為其具有抗腫瘤的功效[5-7]。莽吉柿素來源于藤黃樹的莖皮，研究表明其具有廣泛的抗腫瘤藥理活性，可有效抑制膀胱癌、人膠質瘤等疾病[8-9]，并可通過抑制神經前體細胞表達的發育下調蛋白8活化酶（NAE）復合物的調節亞基活性，從而抑制相關蛋白的Neddylation 修飾，發揮抑制前列腺癌細胞增殖的作用[10]。Luo 等[9]發現莽吉柿素處理人膠質瘤T98G 細胞后，其基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9 的分泌和活性被顯著抑制，推測是由于莽吉柿素對T98G 細胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的調控作用所致。目前，莽吉柿素對于胃癌細胞的體內、外作用效果及機制尚不完全明確，因此，本研究采用噻唑藍（MTT）染色法、克隆形成實驗、Hoechst 染色實驗、蛋白免疫印跡法（Western blot）、裸鼠移植瘤等技術，探究莽吉柿素對人胃癌HGC-27 細胞和人胃癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響及作用機制，為莽吉柿素臨床用藥及莽吉柿素抗腫瘤作用機制的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 細胞與實驗動物

HGC-27細胞購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；雄性BALB/c 裸鼠，4～5 周齡，購自北京維通利華公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物臨床委員會批準（批準編號：BUCM-4-2019120304-4109）。

1.2 試藥

莽吉柿素（批號：PRF10102823，純度≥98%，成都普瑞法科技開發有限公司）；5-氟尿嘧啶（5-FU，批號：B25419，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；RPMI 1640 基礎培養基（批號：10-040-CVR）、青霉素-鏈霉素混合液（批號：30-002-CI）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，批號：25-053-CI）均購于美國Corning 公司；胎牛血清（FBS，批號：04-001-1A，以色列BI 公司）；MTT 細胞增殖和毒性檢測試劑盒（批號：0793，美國Amresco公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（批號：G2002）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（批號：G2003）、ECL 發光液（批號：G2014）、肌動蛋白（β-actin）抗體（批號：GB12001）、Ki67 抗體（批號：ZM-0166）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔抗體（批號：GB23303）、HRP 標記山羊抗小鼠抗體（批號：GB23302）、原位末端轉移酶標記（TUNEL）試劑盒（批號：G1507-50T）均購于武漢Servicebio生物公司；磷酸脫氫酶（GAPDH，批號：60004-1-lg）、β淀粉樣蛋白前體蛋白結合蛋白1（APPBP1，批號：14863-1-AP）、泛素結合酶E2M（UBC12，批號：14520-1-AP）、Bax（批號：60267-1-lg）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2，批號：12789-1-AP）、多聚二磷酸腺苷（ADP）核糖聚合酶1（PARP1，批號：13371-1-AP）、磷酸化的c-Jun（p-c-JUN，批號：28891-1-AP）、磷酸化的c-Jun氨基端激酶（p-JNK，批號：80024-1-RR）抗體均購于美國Proteintech 公司；泛素樣修飾激活酶3（UBA3，批號：ab124728）、磷酸化的p38（p-p38，批號：ab195049）抗體均購于英國Abcam公司。

1.3 儀器

MCO-18AIC 型細胞培養箱（日本三洋公司）；DM500 型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；EnSpire 型多功能酶標儀（美國PerkinElmer 公司）；5424R 型冷凍離心機（美國Eppendorf 公司）；QT-1型渦旋混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；TDL-40B 型低速臺式大型離心機（上海安亭科學儀器廠）；PL4002 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；TDL-40B型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；FACSCantoⅡ型流式細胞儀（美國BD 公司）；XS-500 型高壓蒸汽滅菌器（日本Tomy公司）；DYY-6D 型電泳儀（北京六一儀器廠）；788BR04036型電泳槽及電轉槽（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

將HGC-27 細胞在RPMI 1640 完全培養基（含10%FBS和1%雙抗體）中于37 ℃、飽和濕度和5%CO2下培養。

2.2 MTT染色實驗檢測細胞毒性

培養HGC-27 細胞至對數生長期，胰蛋白酶消化，制成細胞密度為2×104個/mL 的單細胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板。培養24 h后使其完全貼壁，將莽吉柿素母液用完全培養基稀釋成終濃度為2、4、6、8、12 μmol·L-1的工作液，每個濃度設置5 個復孔，分別培養24、48、72 h。將MTT 粉末用磷酸鹽緩沖液（PBS）制備成質量濃度為5 mg·mL-1的初始溶液，然后用DMEM 基礎培養基稀釋10 倍，棄去原培養基，96 孔板中每孔添加100 μL，置于37 ℃培養箱培養4 h后，棄去含MTT的基礎培養基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150 μL。將96孔板用箔紙包裹，置于搖床上水平搖動10 min。用酶標儀在490 nm 處檢測吸光度（A）值，并依照公式（1）計算細胞活力。

2.3 平板克隆形成實驗考察莽吉柿素對HGC-27 細胞克隆形成的影響

將HGC-27 細胞分為4 組，接種在6 mm 培養皿中，每個培養皿500 個細胞，細胞接種后24 h，培養基分別替換為0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素含藥培養基。藥物處理后9 d 后，將培養的細胞固定、結晶紫染色、風干并拍照，觀察細胞集落數目。

2.4 Hoechst染色觀察細胞形態

將處于對數生長期的HGC-27細胞接種于6孔板（細胞密度為50×104個/孔），培養24 h，使其完全附著在板上。棄去培養基，用完全培養基配制終濃度分別為0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素溶液，加入不同孔中。37 ℃培養箱放置48 h 后，用PBS 洗滌3 次，用4%多聚甲醛固定15 min，并在黑暗中用Hoechst 33258 染色溶液染色30 min，將細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

2.5 Western blot實驗檢測蛋白表達

將處于對數生長期的HGC-27細胞接種于6孔板（細胞密度為50×104個/孔），細胞貼壁后，加入完全培養基配制的終濃度為0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素溶液，培養箱中孵育48 h。棄去細胞上清液后，用PBS 洗滌3 次，然后用適量的裂解緩沖液裂解，將其收集到1.5 mL 離心管中。在99 ℃下加熱10 min 后，通過SDS-PAGE 分離蛋白質樣品。然后將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，電轉完成后，將轉好的膜放入含有5%的脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉1.0～1.5 h，加入相關蛋白的一抗，4 ℃孵育過夜。條帶用1×TBST清洗3次，每次10 min，之后加入對應的二抗，室溫搖床慢搖，孵育2 h。取出PVDF膜，條帶用1×TBST清洗3次，每次10 min。將電化學發光（ECL）發光液均勻地加到剪切的條帶上，室溫避光反應1 min、顯影、定影、掃描膠片。使用Photoshop CS6軟件處理結果圖，計算蛋白的相對表達量。

2.6 裸鼠移植瘤實驗

2.6.1 模型制備 BALB/c 裸鼠飼養在SPF 級動物房內，給予滅菌飼料和雙蒸水。室溫維持在23～27 ℃，相對濕度維持在49%～51%，采用12 h循環照明方式。

將密度為1×107個/mL 的HGC-27 細胞懸液在無菌條件下注入BALB/c 裸鼠右前肢的腋窩0.2 mL。整個移植瘤實驗必須在30 min 內完成，以確保良好的細胞活力。每天觀察注射裸鼠的腫瘤狀態。接種11 d 后，裸鼠出現圓形或橢圓形的直徑>5 mm 的皮下硬結節，表明該模型制備成功。

2.6.2 分組與給藥 裸鼠腫瘤體積達到100～200 mm3時，進行分組和給藥。裸鼠分為對照組、5-FU 陽性對照組和莽吉柿素組，每組各7 只。莽吉柿素給藥組裸鼠按55 mg·kg-1的給藥劑量每天腹膜內注射莽吉柿素。對照組裸鼠每天注射相同體積的空白溶劑（含有5% DMSO 和2.5%聚山梨酯-80 的PBS）。參考相關文獻，陽性藥物組按30 mg·kg-1每2 d向裸鼠腹膜內注射5-FU溶液，連續給藥24 d[11]。

2.6.3 腫瘤抑制率計算 給藥后每天觀察裸鼠的一般狀態，稱量裸鼠體質量，以評估莽吉柿素對裸鼠體質量的影響。用游標卡尺測量皮下移植腫瘤的最大直徑（a）和橫向直徑（b），并詳細記錄。根據公式（2）～（3）計算腫瘤體積（V）和腫瘤抑制率（IR）。

2.6.4 移植腫瘤的組織學評估 對裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟進行蘇木精-伊紅（HE）染色。免疫組化法檢測腫瘤組織中Ki67 蛋白表達情況。TUNEL染色檢測細胞凋亡。

2.7 數據統計

實驗數據運用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析，實驗數據用（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 莽吉柿素對HGC-27細胞增殖的影響

不同濃度的莽吉柿素作用不同時間對HGC-27細胞活力的影響見表1。結果表明，莽吉柿素能夠顯著抑制HGC-27 細胞的增殖并且呈時間和濃度依賴性，其作用于HGC-27 細胞24、48、72 h 的半數抑 制 濃 度（IC50）分別 為（9.74±0.97）、（6.85±0.37）、（4.79±0.07）μmol·L-1。根據莽吉柿素的IC50結果，采用4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素進行后續實驗。

表1 不同濃度莽吉柿素作用不同時間對HGC-27細胞活力的影響（,n=3）

表1 不同濃度莽吉柿素作用不同時間對HGC-27細胞活力的影響（,n=3）

結晶紫染色結果（圖1）顯示，與對照組比較，莽吉柿素12 μmol·L-1給藥后HGC-27 細胞集落數目明顯減少，莽吉柿素能夠明顯抑制HGC-27 細胞的集落形成（P<0.01）。

圖1 莽吉柿素對HGC-27細胞集落形成的影響（,n=3）

3.2 莽吉柿素對HGC-27細胞凋亡的影響

Hoechst 33258 可穿透細胞膜，使細胞發出藍色熒光的低毒性DNA 染料，正常細胞在染色后細胞核呈現均勻彌散的藍色熒光，細胞發生凋亡時，細胞膜通透性發生變化，因此染色后細胞核呈現顆粒塊狀的亮藍色熒光[12]。Hosechst 染色結果（圖2）顯示，與對照組比較，莽吉柿素處理HGC-27細胞48 h后，細胞形態發生明顯變化，細胞核呈現亮藍色熒光，并具有濃度依賴性，表明莽吉柿素可促進HGC-27細胞凋亡。

圖2 莽吉柿素對HGC-27細胞形態的影響（標尺為50 μm，400×）

如圖3所示，與對照組比較，莽吉柿素處理48 h后，HGC-27 細胞中凋亡標志物PARP1 的剪切水平升高，細胞中的凋亡蛋白Bax 的表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平下調（P<0.001）。

圖3 莽吉柿素對HGC-27細胞凋亡的影響（,n=3）

3.3 莽吉柿素對HGC-27 細胞中Neddylation 修飾途徑的影響

Western blot 結果（圖4）顯示，與對照組比較，莽吉柿素作用48 h 后，除莽吉柿素4 μmol·L-1組APPBP1 蛋白外，各組HGC-27 細胞中APPBP1、UBA3及UBC12的表達水平均下調（P<0.001）。

圖4 莽吉柿素對HGC-27細胞Neddylation修飾途徑的影響（,n=3）

3.4 莽吉柿素對HGC-27 中MAPK 信號通路相關蛋白表達的影響

MAPK 信號通路蛋白Western blot 結果（圖5）顯示，與對照組比較，莽吉柿素作用48 h后，HGC-27細胞中JUN、JNK 和p38 的磷酸化水平均發生了下調（P<0.001）。

圖5 莽吉柿素對HGC-27細胞中MAPK信號通路的影響（,n=3）

3.5 莽吉柿素對HGC-27 細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用

與對照組比較，莽吉柿素給藥后裸鼠的體質量沒有明顯改變，腫瘤體積縮小18.7%，結果見表2～3。整個實驗過程未出現荷瘤鼠死亡。莽吉柿素干預前14 d，各組裸鼠腫瘤生長速度趨勢一致，14 d 后各組別腫瘤生長呈現出不同趨勢，其中模型組瘤體體積增長速度最快，其次是5-FU組，再次為莽吉柿素給藥組。給藥24 d 后，與對照組比較，5-FU 組和莽吉柿素組裸鼠的瘤體積均呈現出不同程度縮小趨勢，差異有統計學意義（P<0.05）。并且，莽吉柿素組裸鼠的瘤體積小于5-FU 組。

表2 HGC-27細胞移植瘤裸鼠體質量變化（,n=7）

表2 HGC-27細胞移植瘤裸鼠體質量變化（,n=7）

HE 染色結果顯示（圖6），與對照組比較，莽吉柿素組裸鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的形態特征沒有明顯變化。免疫組織化學染色結果顯示（圖7），與對照組比較，莽吉柿素組與腫瘤細胞增殖有關的標志蛋白Ki67 陽性細胞數明顯減少，提示莽吉柿素可以抑制腫瘤細胞增殖。TUNEL 染色結果（圖7）表明，莽吉柿素組裸鼠腫瘤組織切片中的棕色細胞數量明顯增加，表明莽吉柿素可以促進腫瘤細胞凋亡。

圖6 莽吉柿素給藥后HGC-27細胞裸鼠異種移植瘤模型各器官組織HE染色（標尺為50 μm，400×）

圖7 莽吉柿素給藥后HGC-27細胞裸鼠異種移植瘤模型的免疫組化染色分析（標尺為50 μm，400×）

表3 HGC-27移植瘤裸鼠腫瘤生長情況（,n=7）

表3 HGC-27移植瘤裸鼠腫瘤生長情況（,n=7）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

研究發現抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡，可以有效抑制腫瘤的生長[13-19]。莽吉柿素具有良好的抗腫瘤作用[20]，然而其對胃癌的作用效果和相關作用機制還不是十分清楚，有待于進一步闡明。本研究發現莽吉柿素能夠明顯抑制HGC-27 細胞的增殖能力。

目前，很多臨床上使用的抗癌藥物通過誘導細胞凋亡來引發癌細胞死亡[21-24]。PARP 蛋白是存在于細胞核中用以重組與修復DNA 的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，PARP 蛋白被活化的Caspase-3 剪切，是細胞發生凋亡的重要標志。本研究發現，莽吉柿素能夠上調PARP1 的剪切水平和Bax 蛋白表達水平，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。因此推測莽吉柿素誘導HGC-27 細胞凋亡可能與促進Bax 表達、抑制Bcl-2表達的途徑相關。

Neddylation修飾是蛋白質翻譯后修飾方式之一，不僅可以造成多種底物蛋白泛素化降解，還可通過修飾底物蛋白，廣泛參與多種信號傳導途徑的調節[25-26]。Neddylation 修飾與腫瘤發生發展關系密切，廣泛的參與調控腫瘤的細胞周期、凋亡、衰老、自噬、血管生成以及免疫細胞等多種過程[27]。本研究發現，莽吉柿素作用之后，HGC-27 細胞中APPBP1、UBA3 及UBC12 的表達水平均發生了下調。因此推測，抑制人胃癌細胞HGC-27 中MAPK信號通路相關蛋白的Neddylation 修飾可能是莽吉柿素抑制HGC-27細胞生長的機制之一。

MAPK信號通路在調節細胞增殖、凋亡、分化、遷移和黏附等過程中發揮了重要作用。c-Jun、JNK與p38 的表達失調與腫瘤的發生發展密切相關，研究表明，c-Jun、JNK 和p38 抑制劑可以有效抑制腫瘤的生長[28]。田穎穎等[11]研究發現，抑制MAPK 信號通路可能是槐耳清膏抑制NCI-H1299 細胞生長和轉移的機制。本研究發現，莽吉柿素給藥能夠抑制HGC-27細胞c-Jun、JNK和p38的磷酸化水平，提示在HGC-27 細胞中莽吉柿素能夠抑制MAPK 信號通路。因此，推測MAPK 信號通路的下調可能部分介導了莽吉柿素抗胃癌作用。

體內抗腫瘤研究表明，腹腔注射給藥55 mg·kg-1的莽吉柿素后，裸鼠移植瘤的生長得到了顯著抑制，而體質量、精神狀態、飲食和飲水未受明顯影響。腫瘤組織HE切片染色結果表明，與對照組相比，莽吉柿素對裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等器官組織并沒有表現出明顯毒性。

Ki67 蛋白的表達水平通常被用來評估細胞的增殖水平，Ki67 蛋白含量越高表明細胞增殖活性越強[26]。免疫組化實驗結果表明，在注射了莽吉柿素的裸鼠體內，Ki67 蛋白的表達水平顯著降低，提示莽吉柿素使HGC-27細胞的增殖活性受到抑制。

TUNEL 實驗通常用于分析組織或細胞的凋亡[29-30]。本研究結果顯示，與對照組相比，莽吉柿素組裸鼠的腫瘤組織細胞凋亡明顯增強。因此，莽吉柿素可通過阻止腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡而明顯抑制裸鼠HGC-27細胞移植瘤的生長。

綜上所述，體外研究發現，莽吉柿素能夠抑制HGC-27細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制其類泛素化修飾過程。莽吉柿素還能夠抑制HGC-27 細胞中MAPK 信號通路。體內研究發現，莽吉柿素能夠顯著抑制裸鼠體內HGC-27 細胞移植瘤的生長。因此，推測莽吉柿素是潛在的天然抗胃癌活性成分，具有一定的臨床開發價值。