遠志黃曲霉毒素檢測及其貯藏過程中黃曲霉菌變化研究△

常曉茜，姜丹，王鈞楠，李婷，任廣喜，米久，金敏，華國棟，劉春生*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；

2.西藏藏醫藥大學，西藏 拉薩 850000；

3.北京市中西醫結合醫院，北京 100039；

4.北京中醫藥大學 東直門醫院，北京 100700

遠志是遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠志P.sibiriaL.的干燥根，性溫，味辛、苦，歸心、腎、脾經，具有安神益智、祛痰、消腫的功效[1]。在臨床使用中，遠志的需求量很大，是大宗中藥材之一，始載于《神農本草經》[2]，列為上品。然而，近年來遠志的黃曲霉毒素（aflatoxins）超標問題直接影響了其臨床使用的安全性。黃曲霉毒素是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）等曲霉屬真菌產生的次生代謝產物，具有致畸、致癌、致突變等作用，嚴重危害人體和動物的健康[3]。因此《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規定了黃曲霉毒素作為遠志的檢查項目[1]，限度要求為黃曲霉毒素B1不得超過5 μg·kg-1；黃曲霉毒素總量[黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）]不得超過10 μg·kg-1。遠志屬于黃曲霉毒素檢出率較高的藥材，污染主要產生于遠志的種植、采收、加工和貯藏等過程中[4]。

在遠志的產地采收加工及運輸貯藏過程中，極易由于操作不當使遠志筒不能及時干燥，導致黃曲霉菌在筒內部繁殖，若儲存過程中環境潮濕陰暗，則會加劇黃曲霉菌的繁殖，易造成黃曲霉毒素超標[5]。田洪嶺等[6]發現，藥農在采收遠志后，為了防止其水分蒸發，常用封閉的塑料袋保存新鮮遠志條，高溫密閉易使遠志藥材表面滋生黃曲霉菌，進而導致黃曲霉毒素超標。本課題組通過調研得知，遠志在北京臨床應用比較廣泛。本研究對12 批不同產地的遠志進行黃曲霉毒素含量的測定，同時觀察在北京貯藏過程中不同時間遠志表面黃曲霉菌的變化，探究貯藏過程對遠志表面黃曲霉菌的影響，以期為科學防控遠志黃曲霉毒素污染提供參考。

1 材料

1.1 試藥

12批遠志藥材，7批來自山西，其余5批分別來自河北、陜西、河南、內蒙古、貴州，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根，具體信息見表1。

表1 遠志樣品信息

真菌基因組DNA 快速提取試劑盒（批號：3621755）、2×TaqPCR MasterMix（批號：MT201-02）均購于北京博邁德科技發展有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；黃曲霉毒素混合對照品溶液（批號：610001-201703，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、甲酸均為質譜級（美國Fisher 公司）；色譜級甲醇（北京市通廣精細化工公司）；氯化鈉（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器

Xevo TQS Micro型超高效液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀、ACQUITYUPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）均購自美國Waters 公司；YXQ-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫療有限公司）；GL-88B 型渦旋振蕩器（海門市斯林貝爾儀器制造有限公司）；XSP-44X.9型顯微鏡（上海光學儀器一廠）；3K15 型低溫高速離心機（德國Sigma 公司）；TProfessional Standard Gradient 96 型梯度聚合酶鏈式反應（PCR）熱循環儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；FMB40 型雪花制冰機（上海比朗儀器有限公司）；BG-gds AUTO520 型凝膠成像系統（南京華奧儀器有限公司）；MM400 型混合球磨儀（上海弗爾德萊馳有限公司）；JY-SP3型電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；P2161E25 型免疫親和柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

2 方法

2.1 遠志表面黃曲霉菌的鑒定

2.1.1 黃曲霉菌株培養 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：取馬鈴薯200 g 洗凈削皮，切成小塊，加入去離子水1000 mL煎煮30 min，8層紗布濾過，加入無水葡萄糖20 g，瓊脂18 g，攪拌溶解，115 ℃滅菌20 min后分裝，備用。

將遠志藥材去除雜質后混勻，隨機稱取1 g放入無菌離心管中，加入無菌水10 mL，渦旋混勻15 min，超聲15 min，充分混勻后取500 μL 均勻涂布在PDA培養基上，28 ℃避光培養7 d，采用菌絲頂端純化法，挑取培養基中形態上與黃曲霉菌相似的菌落接種至新的PDA 培養基，28 ℃避光培養7 d，對獲得的黃曲霉菌菌株進行形態、顯微及DNA分子鑒定。

2.1.2 形態鑒定 根據《真菌鑒定手冊》[7]進行真菌的形態特征鑒定。

2.1.3 顯微鑒定 無菌接種環挑取少量真菌置于載玻片上，用適量乳酸酚棉藍染色液滴至載玻片上，染色30 s后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

2.1.4 DNA 分子鑒定 用無菌接種環刮取培養基表面的真菌置于1.5 mL 離心管，加入液氮，使用球磨儀磨碎。參照真菌基因組DNA 快速提取試劑盒說明書提取菌落DNA。PCR 反應體系為DNA 模板1 μL、引物各1 μL、2×TaqPCR Master聚合酶15 μL、雙蒸水12 μL，體系總體積30 μL。引物序列為ITS1：5′-AGAAGTCGTAAGGTTTCCGT-3′，ITS4：5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反應程序為94 ℃預變性90 s，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環，72 ℃延伸5 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性結果送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。采用ContigExpress 軟件對測序得到的正反向序列進行拼接及人工校對。根據美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫進行BLAST 同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的內轉錄間隔區（ITS）序列，用DNAMAN進行相似度分析，采用MEGA 6.0軟件構建臨接（neighbor joining，NJ）樹進行鑒定。

2.2 遠志黃曲霉毒素測定

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為0.1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～0.5 min，90%A；0.5～6.0 min，90%～10%A；6～7 min，10%A；7～9 min，10%～90%A；9～10 min，90%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL·min-1；進樣量為2 μL。

2.2.2 質譜條件 以三重四級桿串聯質譜儀檢測；電噴霧離子源（ESI），采集模式為正離子模式；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流速為1000 L·min-1；毛細管電壓為0.50 kV[8]。各化合物檢測離子對和碰撞電壓見表2。

表2 遠志中黃曲霉毒素質譜分析參數

2.2.3 混合對照品溶液制備 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標示質量濃度分別為1.09、0.39、0.99、0.64 μg·mL-1）適量，用70%甲醇稀釋成AFB2、AFG2質量濃度為0.38～160.00 ng·mL-1，AFB1、AFG1質量濃度為0.13～68.13 ng·mL-1的系列對照品溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 遠志供試品溶液的制備參照《中國藥典》2020 年版黃曲霉毒素測定法（通則2351）進行。

2.2.5 樣品測定 樣品測定方法參考廖權豐等[7]的研究，分別精密吸取2.2.3 項下系列混合對照品溶液各2 μL，注入超高效液相色譜三重四級桿串聯質譜儀，測定峰面積，以待測黃曲霉毒素定量離子色譜峰面積為縱坐標（Y），黃曲霉毒素質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。精密吸取供試品溶液2 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計算AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量。

2.3 不同時段遠志表面黃曲霉菌的培養

將12 批不同產地的遠志藥材用牛皮紙袋包裝，貯藏于北京市房山區良鄉鎮北京中醫藥大學中藥學院，每個月按2.1項下的稀釋平板法培養其表面的黃曲霉菌，每個實驗組設置3個重復，分別記錄北京2019年不同時間段（6―12月）遠志表面的黃曲霉菌數量。

3 結果與分析

3.1 遠志表面黃曲霉菌的鑒定

將遠志表面的黃曲霉菌進行培養，其在PDA 平板上生長迅速，顏色由黃綠色變為黃色，可見黃色粉末，見圖1。顯微鏡下可見分生孢子頭呈疏松放射狀，分生孢子梗由一根直立的菌絲形成，末端有近球狀或球狀膨大的頂囊，視野中可見大量球形或近球形的孢子，與文獻報道一致[9]。該菌的PCR 產物在凝膠成像系統觀察到條帶清晰明亮，構建NJ樹，見圖2。綜上結果表明，該菌與黃曲霉菌聚為一支，鑒定為黃曲霉菌（Aspergillus flavus）。

圖1 遠志表面真菌、黃曲霉菌的培養平板及顯微觀察

圖2 遠志中黃曲霉菌的NJ樹

3.2 遠志黃曲霉毒素污染情況

3.2.1 黃曲霉毒素的MRM 色譜圖 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的多反應監測（MRM）色譜圖見圖3。

圖3 遠志中4個黃曲霉毒素的MRM色譜圖

3.2.2 線性關系及檢出限 黃曲霉毒素質量濃度與定量離子峰面積之間存在良好的線性關系，見表3。

表3 遠志中4個黃曲霉毒素的回歸方程、相關系數

3.2.3 精密度試驗 取黃曲霉毒素的混合對照品溶液，連續進樣6 次，每次2 μL，分別計算AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積RSD 為0.97%、1.03%、0.88%、1.25%，表明儀器精密度好。

3.2.4 重復性試驗 精密稱取同一批次已知含量藥材粉末6 份，按上述供試品制備方法制得供試品溶液，按色譜質譜條件檢測，進樣量為2 μL，依據回歸方程計算黃曲霉毒素的含量，AFB1質量分數均值為3.29 μg·kg-1，RSD為1.02%。

3.2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的藥材粉末6份，精密稱定，分別加入黃曲霉毒素混合對照品溶液，按上述供試品制備方法制得供試品溶液，按色譜質譜條件進樣，進樣量為2 μL，測得AFB1的加樣回收率為89.3%，RSD 為2.78%、AFB2的加樣回收率為84.9%，RSD 為1.98%；AFG1的加樣回收率為83.1%，RSD 為2.43%；AFG2的加樣回收率為85.3%，RSD為2.83%。

3.2.6 遠志黃曲霉毒素污染情況 在12 批不同產地的遠志中均檢出AFB1，檢出質量分數為0.75～7.77 μg·kg-1，其中1 批樣品（河北邢臺）還檢測出AFG1，檢出質量分數為10.60 μg·kg-1，AFB2和AFG2均未檢出。4 批（山西運城2 批，河北邢臺、河南洛陽各1 批）遠志的AFB1含量超過《中國藥典》2020年版限量標準，其中1批樣品（河北邢臺）的AFB1和黃曲霉毒素總量均超過《中國藥典》2020年版限量標準，具體結果見表4。

表4 不同產地遠志表面黃曲霉毒素質量分數 μg·kg-1

3.3 遠志表面的黃曲霉菌隨貯藏時間變化情況

12 批不同產地的遠志表面均分離到黃曲霉菌，黃曲霉菌污染率為100%，見圖4。其中7―9 月遠志表面的黃曲霉菌數量最多，6 月與10 月遠志表面的黃曲霉菌數量最少，見表5。

表5 不同貯藏時間遠志表面的黃曲霉菌數量 CFU·g-1

圖4 不同貯藏時間遠志表面的真菌

北京2019 年6―12 月的溫濕度與遠志表面黃曲霉菌數量的變化情況如圖5 所示，遠志藥材儲存地點的溫濕度條件與外界環境一致。

圖5 北京2019年6—12月溫、濕度與遠志表面黃曲霉菌數量變化

4 討論

2017—2018 年全國藥品質量專項抽檢公告[10]的共計21 批遠志樣品中，黃曲霉毒素含量不合格率高達90.5%，嚴重影響了遠志的臨床使用。本研究采用UPLC-MS/MS 檢測了12 批不同產地的遠志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量，結果發現，12批遠志的黃曲霉毒素污染率為100%，按照《中國藥典》2020 年版遠志項下的規定，33.3%的樣品超過了AFB1和黃曲霉毒素總量限量標準。其中，山西省運城市聞喜縣作為遠志的道地產區，在測定的7 批藥材中有2 批AFB1含量超標，以上結果更進一步說明了遠志黃曲霉毒素污染問題的嚴重性。

遠志的采收及加工過程中容易因干燥不及時而滋生黃曲霉菌[11]。張西梅等[12]研究發現，田間生產和采收加工都有可能造成遠志黃曲霉毒素污染，而貯藏過程對其變化的影響尚不明確。因此本實驗研究了北京不同時間的貯藏過程對遠志表面黃曲霉菌的影響。分析發現，6—9 月北京的溫度、濕度都處于較高的狀態，遠志表面的黃曲霉菌數量最多；11、12 月溫、濕度最低，遠志表面黃曲霉菌的數量處于較低的水平。徐圓程等[13]利用高通量測序技術分析貯藏稻谷中的群落結構，指出不同貯藏條件下稻谷真菌群落多樣性存在差異，優勢菌屬發生變化。本研究中，10 月遠志表面的黃曲霉菌數量最少，之后有所回升。推測可能是由于季節變換，氣溫驟降，優勢菌群快速生長，不利于黃曲霉菌的生長所致，后期需進一步擴大樣本量，探究不同貯藏條件下遠志表面菌群的群落結構與優勢菌屬。調查結果為制定合理的遠志貯藏條件提供了一定的參考。特別是在炎熱悶熱的夏季，遠志貯藏應保持通風的條件。本實驗采用UPLC-MS/MS測定了12批不同產地遠志黃曲霉菌的污染情況，并對北京不同時間下遠志表面的黃曲霉菌生長情況進行研究，后續將進一步考察具體的貯藏條件對遠志黃曲霉毒素含量的影響，深入研究遠志黃曲霉毒素污染問題。