基于HPLC-LTQ-Orbitraps-MSn分析比較酸棗仁-五味子藥對單煎液和合煎液化學成分△

王曉玫，劉潔，2，丁永勝，3，羅靜，4，趙程博文，5，姚子蔚，李秋雨，3，劉金鳳，于佳禾，魏曉嘉，李佳園，萬國慧，金重先，王雨青，楊雪，呂研，邊麗華，王春國*，石晉麗*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；

2.首都兒科研究所 附屬兒童醫院，北京 100020；

3.華潤雙鶴藥業股份有限公司，北京 100102；

4.重慶藥友制藥，重慶 401121；

5.北京中醫藥大學 東直門醫院，北京100700

酸棗仁來源于鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子[1]382-384，主要含三萜（含三萜皂苷）、黃酮、生物堿等成分。五味子來源于為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實[1]68，主要含木脂素、揮發油、降三萜等成分。基于脫胎于《神農本草經》的藥對理論的指導，兩者配伍可全方位補心氣、安心神[2]，常聯合應用治療失眠、健忘、焦慮等臨床疾病，酸棗仁-五味子配伍比例以1∶1 和2∶1 為主[3]。本課題組前期研究發現，炒酸棗仁-醋五味子2∶1配伍時，具有顯著的抗焦慮作用[4]。有研究者采用超高效液相色譜法（UPLC）和高效液相色譜法（HPLC）對酸棗仁-五味子1∶1配伍藥對進行指紋圖譜分析和含量測定[5-6]，發現配伍后斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素5 個成分的溶出均降低，認為與煎煮過程中的大量沉淀有關[5]。早在2009 年，王衛記等[7]運用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法（HPLC-ESI-MSn）技術，從酸棗仁有效部位中鑒定出13 個化合物；2018 年，毛怡寧等[8]通過超高效液相色譜-線性離子阱串聯靜電場軌道阱聯用質譜法（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS）技術，從酸棗仁中鑒定、推斷出24 個化合物和4 個未知化合物；夏麗文等[9]應用超高效液相色譜-電噴霧飛行時間質譜（UPLC-ESI-TOF/MS）技術在五味子中表征出24 個峰并初步鑒定了17個峰。目前，尚未見酸棗仁-五味子2∶1 配伍前后化學成分變化的報道。本研究利用HPLC-LTQ-Orbitraps-MSn技術對該藥對2∶1配伍前后的化學成分進行分析、比較，為進一步研究兩者配伍作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Accela 600 pump 型高效液相色譜儀、LTQOrbitrap XL 型質譜儀，配有加熱電噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 2.1 化學工作站（美國Thermo Scientific 公司）；R200D 型分析天平（十萬分之一，德國Satorius公司）。

1.2 試藥

對照品蘆丁（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707，純度≥98%）；五味子醇乙（上海源葉生物科技有限公司，批號：P14N10F103016，純度≥98%）；五味子酯甲（四川維克奇生物科技有限公司，批號：wkq16050901，純度≥98%）；乙醇（北京化工廠，分析純）；娃哈哈礦泉水（杭州娃哈哈集團有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，質譜純）。

炒酸棗仁（批號：20150601）購于四川禾一天然藥業有限公司，醋五味子（批號：20160122）購于吉林省元力藥業有限公司，經北京中醫藥大學石晉麗教授鑒定，分別為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實。

2 方法

2.1 分析樣品制備

單煎液樣品制備：精密稱取炒酸棗仁30.03 g、醋五味子30.02 g，分別置于500 mL 圓底燒瓶中，2 個樣品均加8 倍量80%乙醇浸泡30 min，加熱回流1 h，濾過；濾液備用，濾渣加10 倍量純水，加熱回流提取1 h，濾過，合并2次濾液，濃縮并用甲醇定容于25 mL量瓶中，得酸棗仁單煎液樣品、五味子單煎液樣品。

合煎液樣品制備：精密稱取炒酸棗仁20.01 g，醋五味子10.00 g，制法同上。以上樣品分別過0.45 μm微孔濾膜于液相進樣瓶中備用。

2.2 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%～3%A；5～8 min，3%～9%A；8～30 min，9%～11%A；30～32 min，11%～18%A；32～52 min，18%～19%A；52～67 min，19%～25%A；67～74 min，25%～43%A；74～78 min，43%～52%A；78～89 min，52%～55%A；89～114 min，55%～95%A）；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm；進樣量為4 μL。

2.3 質譜條件

HESI源電壓（正離子模式3.0 kV，負離子模式4.0 kV）；干燥氣流速：15 L·min-1，干燥氣體溫度（正離子模式300 ℃，負離子模式350 ℃）；毛細管溫度：250～350 ℃；碰撞電壓：6～10 V；掃描范圍：m/z100～1500。采用傅里葉變換高分辨全掃方式（TF，Full scan，Resolution 30 000) 和數據依賴性（data-dependent acquisistion）ddMS2和ddMS3方法獲取各級質譜碎片。

3 結果

3.1 配伍前后整體分析

酸棗仁、五味子藥對（2∶1）單煎液、合煎液在正、負離子模式下的總離子流圖（TIC）見圖1～6。

圖2 酸棗仁單煎液負離子模式TIC及UV 254 nm響應

圖3 五味子單煎液正離子模式TIC及UV 254 nm響應

圖4 五味子單煎液負離子模式TIC及UV 254 nm響應

圖5 酸棗仁-五味子（2∶1）合煎液正離子模式TIC及UV 254 nm響應

圖6 酸棗仁-五味子（2∶1）合煎液負離子模式TIC及UV 254 nm響應

根據保留時間信息、高分辨質譜精確相對分子質量和多級碎片信息，與已報道的相關化合物碎片進行比對分析，在酸棗仁單煎液正、負離子模式下共對50 個色譜信號進行化學成分鑒定，指認出其中10 個（黃酮類6 個、生物堿2 個、皂苷2 個）近10 年報道過指紋圖譜分析或含量測定的化合物，并發現8 個黃酮類化合物在正、負離子模式下均可檢出；在五味子單煎液正、負離子模式下共對32 個色譜信號進行化學成分鑒定，指認出10個近10年報道過指紋圖譜分析或含量測定的成分（均為木脂素類）；在酸棗仁-五味子藥對（2∶1）合煎液正、負離子模式下共對50 個色譜信號進行化學成分鑒定，指認出19個近10年報道過指紋圖譜分析或含量測定的成分（黃酮類5 個、生物堿1 個、皂苷1 個、木脂素類12 個），這些成分在各自單煎液中均已被指認。合煎液未檢出單煎液中可檢出的1 個酸棗仁皂苷（酸棗仁皂苷B）和1 個具有同分異構體的酸棗仁生物堿（酸李堿或木蘭花堿）。酸棗仁與五味子單煎液中指認出的共計21 個成分，除去前述的酸棗仁皂苷B、酸李堿或木蘭花堿，即為本研究在合煎液中指認出的19 個成分。在檢出成分個數略有減少的同時，合煎液中檢出了1 個來自五味子的同分異構體離子峰，該峰在單煎液中未檢出，筆者認為這是值得注意的。

來源于酸棗仁或五味子的近10 年報道過指紋圖譜分析或含量測定的化合物，在酸棗仁單煎液中指認出的10個，分別為文賽寧-Ⅱ[10-11]、6?-對羥基苯甲酰斯皮諾素[10-11]、6?-阿魏酰斯皮諾素[10-11]、6?-對香豆酰斯皮諾素[10]、蘆丁[12]、斯皮諾素[7-8]（以上6 個為黃酮類）、酸李堿[13]、木蘭花堿[14]（以上2 個為生物堿）、酸棗仁皂苷A[15-16]、酸棗仁皂苷B[15-16]（以上2 個為皂苷）；在五味子單煎液中指認出的10個木脂素類成分為五味子醇甲[17]、五味子醇乙[17]、五味子酯甲[17]、五味子甲素[17]、五味子乙素[17]、五味子丙素[17]、五味子酚[18]、五味子酯乙[18]、戈米辛D[19]和戈米辛J[19]。酸棗仁單煎液正、負離子模式下均可檢出的8個化合物是異牡荊素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、當藥黃素、6?-香草酰斯皮諾素、6?-對羥基苯甲酰斯皮諾素、異牡荊素-2″-O-6-阿魏酰-葡萄糖苷、6?-芥子酰斯皮諾素、6?-對香豆酰斯皮諾素、6?-（-）-phaseoylspinosin，其中，當藥黃素和6?-對羥基苯甲酰斯皮諾素在合煎液正、負離子模式下均可檢出，6?-香草酰斯皮諾素、6?-對香豆酰斯皮諾素僅在合煎液負離子模式下可見檢出，6?-（-）-phaseoylspinosin和異牡荊素-2″-O-6-阿魏酰葡萄糖苷在合煎液中未檢出。

酸棗仁、五味子單煎液與合煎液的共有成分和特有成分種類見圖7（所有在同一樣品的正、負離子模式下均可檢出的化合物在該樣品中僅保留1 次）。由圖7 可見，酸棗仁單煎液中1/2 的色譜信息和五味子單煎液中大部分的色譜信息在合煎液中也存在，合煎液中存在2 個特有成分，為戈米辛L1/L2/M1/M2信號3和9，12-亞油酸同分異構體信號2；其中戈米辛L1/L2/M1/M2信號3 有較大研究意義，表明合煎液中新增了五味子木脂素離子峰。

圖7 酸棗仁、五味子單煎液與合煎液（2∶1）韋恩圖

3.2 酸棗仁單煎液分析

酸棗仁單煎液中鑒定出50 個色譜信號，除2 個有機酸及其糖苷類成分［24-羥基美洲茶酸、美洲茶酸（出現2 次）］、4 個生物堿類成分（烏藥堿、酸李堿/木蘭花堿、木蘭花堿/酸李堿、6-葡萄糖-烏藥堿）、5 個皂苷類成分（原酸棗仁皂苷A、原酸棗仁皂苷B、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、乙酰酸棗仁皂苷）外，其余成分均為黃酮類化合物。本研究對酸棗仁單煎液的鑒定結果見表1。以黃酮類成分為例進行分析。

表1 HPLC-LTQ-Orbitrap MSn分析的酸棗仁單煎液中化合物

續表1

續表1

酸棗仁中的黃酮類化合物大多為黃酮碳苷，在正離子模式下可少量檢出；在負離子模式下，可較多檢出，而且質譜裂解有較強的規律性，一般在與苷元直接相連的六碳糖上產生碎裂，脫去60（-CHO-CH2OH）、90（-CHOH-CHO-CH2OH）、120（-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH）質量單位的碎片峰[8,23-24]，見圖8[23]。

圖8 黃酮C-糖苷糖環的裂解規律

如化合物7準分子離子峰為m/z593[M-H]-，二級質譜為m/z533[M-H-60]-，m/z503[M-H-90]-，m/z473[M-H-120]-，m/z413[M-H-120-60]-，m/z383[M-H-120-90]-，m/z353[M-H-120-120]-，2 次脫去60、90、120 質量單位的碎片離子，可以推斷化合物7 為由2 個六碳糖分別與苷元直接相連的黃酮二碳苷。化合物12準分子離子峰為m/z593[M-H]-，二級質譜為m/z413[M-H-Glc-H2O]-，m/z353[M-H-Glc-H2O-60]-，m/z293[M-H-Glc-H2O-120]-，有規律地產生脫去60、90、120質量單位的碎片峰，基本可以判斷為六碳糖的黃酮碳苷類化合物。化合物15 準分子離子峰為m/z607[M-H]-，二級質譜為m/z445[M-H-Glc]-，m/z427[M-H-Glc-H2O]-，m/z367[M-H-Glc-H2O-60]-，m/z337[M-H-Glc-H2O-90]-，m/z325[M-H-120-Glc]-，m/z307[M-H-Glc-H2O-120]-。化合物18 準分子離子峰為m/z455 [M-H]-，二級質譜為m/z385[M-H-60]-，m/z355[M-H-90]-，m/z325[M-H-120]-，m/z297[M-H-120-CO]-，m/z281 [M-H-120-CO-CH3]-，以上離子碎片符合當藥黃素的裂解規律。化合物31準分子離子峰為m/z813 [M-H]-，二級質譜為m/z607 [M-Hsinapoyl]-，m/z427[M-H-sinapoyl-Glc-H2O]-，m/z337 [M-H-sinapoyl-Glc-H2O-90]-，m/z307[M-H-sinapoyl-Glc-H2O-120]-，以上離子碎片符合6?-芥子酰斯皮諾素的裂解規律。結合文獻[7,12,20]推測化合物7、12、15、18、31 分別為6，8-二碳葡萄糖基芹菜素（文賽寧-Ⅱ，維采寧）、異牡荊素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、斯皮諾素、當藥黃素、6?-芥子酰斯皮諾素。化合物24、34、39、42一級質譜分別出現m/z942 [M-H]-，943 [M-H]-，711[M-H]-，1118[M-H]-，二級質譜均出現m/z607，445，427 等碎片離子，與斯皮諾素的質譜行為相似，提示其在C-6 處具有和斯皮諾素相同的結構骨架和2 個糖基團（葡萄糖），推測其為斯皮諾素類黃酮碳苷化合物[19-20]。6，8-二碳葡萄糖基芹菜素（文賽寧-Ⅱ，維采寧）可能的裂解途徑見圖9。

圖9 6，8-二碳葡萄糖基芹菜素（文賽寧-Ⅱ，維采寧）可能的裂解途徑

3.3 五味子單煎液分析

五味子單煎液中鑒定出32個色譜信號，除12個有機酸、內酯類成分（異檸檬酸、檸檬酸、披針葉五味子二內酯C同分異構體1～3、披針葉五味子二內酯C、9，12-亞油酸同分異構體1、α-亞麻酸或同分異構體信號1、α-亞麻酸或同分異構體信號2、內消旋二氫愈瘡木酯酸、α-亞麻酸或同分異構體信號3、9，12-亞油酸）外，其余成分均為木脂素類化合物。本研究對五味子單煎液的鑒定結果見表2[9,25-41]。

表2 HPLC-LTQ-Orbitrap MSn分析的五味子單煎液中化合物

續表2

續表2

以木脂素類成分為例進行分析。五味子木脂素類化合物須在正離子模式下檢測。常丟失-CH3、-OCH3、-CH3OH、-C5H10、-C6H5COOH、-C2H4O、-CH2O等基團，生成相應的質譜碎片。其中化合物12和19的誤差均介于-5～-10。五味子酯甲與戈米辛G 為同分異構體，具有相似的裂解途徑（圖10）。故將五味子醇乙、五味子酯甲和存在于酸棗仁等多種常見中藥中的化合物蘆丁配制成的混合對照品在正離子模式下進樣分析（圖11），確定其中m/z399（tR21.29，圖11 中藍色實線框所示）和m/z415（tR23.88，圖11 中紅色實線框所示）分別為此體系下五味子醇乙（C23H28O7）離子化并脫去1 H2O 和五味子酯甲（C30H32O9）離子化并脫去1 C7H6O2后形成的離子峰，結合參考文獻[32,36]，確定化合物12為五味子醇乙，推測化合物19可能為五味子酯甲或戈米辛G。

圖10 戈米辛G、五味子酯甲結構式及戈米辛G可能的裂解途徑

圖11 混合對照品在正離子模式下的TIC、UV（254 nm）響應及五味子醇乙（tR 21.29 min）、五味子酯甲（tR 23.88 min）MS一級碎片

3.4 酸棗仁-五味子合煎液（2∶1）分析

合煎液中鑒定出58個色譜信號，其中23個信號（因當藥黃素和6?-對羥基苯甲酰斯皮諾素在正、負離子模式下均可檢出，實為21 個化合物）來自酸棗仁，約占酸棗仁單煎液中檢出化合物的1/2；32個信號來自五味子，即五味子單煎液中的絕大部分化合物在合煎液中可檢出。本研究對酸棗仁-五味子合煎液（2∶1）的鑒定結果見表3[7-8,12,20-42]。與五味子單煎液不同的是，合煎液比單煎液在C22H26O6同分異構體（m/z387.18）提取離子流圖（EIC）tR48.52 min附近多出明顯的離子流峰，一級質譜檢出時間可認為在tR48.48 min（C22H26O6母離子誤差為-2.170）。結合文獻推測，合煎液中發生了來自五味子木脂素類化合物的轉化[42]。三級離子的提取結果佐證了以上猜想（以387.18 為一級離子進行三級離子提取，結果顯示,二級離子分別為m/z325.16、325.13、355.15、357.20 時可在五味子單煎液中提取到三級離子，二級離子分別為m/z325.13、325.22、355.21（2 次）、357.13 時可在酸棗仁-五味子（2∶1）合煎液中提取到三級碎片，即合煎液比單煎液在二級離子m/z355.21處多了1個三級離子的提取結果）。

3.5 酸棗仁-五味子合煎液（2∶1）分析

合煎液中鑒定出58個色譜信號，其中23個信號（因當藥黃素和6?-對羥基苯甲酰斯皮諾素在正、負離子模式下均可檢出，實為21 個化合物）來自酸棗仁，約占酸棗仁單煎液中檢出化合物的1/2；32個信號來自五味子，即五味子單煎液中的絕大部分化合物在合煎液中可檢出。本研究對酸棗仁-五味子合煎液（2∶1）的鑒定結果見表3[7-8,12,20-42]。與五味子單煎液不同的是，合煎液比單煎液在C22H26O6同分異構體（m/z387.18）提取離子流圖（EIC）tR48.52 min附近多出明顯的離子流峰，一級質譜檢出時間可認為在tR48.48 min（C22H26O6母離子誤差為-2.170）。結合文獻推測，合煎液中發生了來自五味子木脂素類化合物的轉化[42]。三級離子的提取結果佐證了以上猜想（以387.18 為一級離子進行三級離子提取，結果顯示，二級離子分別為m/z325.16、325.13、355.15、357.20 時可在五味子單煎液中提取到三級離子，二級離子分別為m/z325.13、325.22、355.21（2 次）、357.13 時可在酸棗仁-五味子（2∶1）合煎液中提取到三級碎片，即合煎液比單煎液在二級離子m/z355.21處多了1個三級離子的提取結果）。

表3 HPLC-LTQ-Orbitrap MSn分析的酸棗仁-五味子合煎液（2∶1）中化合物的質譜數據

續表3

續表3

4 討論

一般而言，具有堿性基團的化合物適合質譜正離子模式分析，具有酸性基團的化合物適合質譜負離子模式分析[8]。酸棗仁、五味子中同時具有堿性和酸性基團，理論上在質譜正、負離子模式下均有響應值，故本實驗分別選用正、負離子模式對酸棗仁單煎液、五味子單煎液、酸棗仁-五味子（2∶1）合煎液進行分析，較為全面地進行了以上三者的化學成分表征。酸棗仁單煎液中10 個曾做過含量測定的化合物中，只有2 個黃酮類成分（6?-對羥基苯甲酰斯皮諾素、6?-對香豆酰斯皮諾素）在正、負離子模式下可同時檢出，其余4個黃酮類（文賽寧-Ⅱ、6?-阿魏酰斯皮諾素、蘆丁、斯皮諾素）、2 個生物堿（酸李堿、木蘭花堿）、2個皂苷（酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B）成分僅在負離子模式下可檢出，驗證了負離子模式適宜分析酸棗仁中的化合物（黃酮和三萜皂苷類化合物均含有多個羥基等酸性基團，在負離子模式下，羥基易形成穩定的氧負離子[8]），對酸棗仁的化學成分研究結果進行了補充。

相關研究對酸棗仁-五味子藥對1∶1配伍的單煎液、合煎液進行了UPLC指紋圖譜分析和HPLC含量測定[5-6]，在酸棗仁單煎液指紋圖譜中確定了11 個共有峰，在五味子單煎液指紋圖譜中確定了10 個共有峰，在酸棗仁-五味子合煎液指紋圖譜中確定了16個共有峰，并鑒定了其中的斯皮諾素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素5 個成分；發現與單煎液相比，除五味子甲素外，合煎液中的斯皮諾素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素的溶出成分峰面積均降低；酸棗仁皂苷A 與五味子醇甲的含量在合煎液中顯著降低，與單煎液差異有統計學意義（P<0.01）；本研究在合煎液中酸棗仁皂苷B缺失的結果與之顯示出一致趨勢。

此外，本研究以80%乙醇和水各進行1 h加熱回流提取，較全面地提取了其中的化合物；在此前提下，合煎液中鑒定出的酸棗仁化合物在數量上僅為單煎液中的1/2，五味子中的戈米辛R、戈米辛N、γ-五味子素（及1 個α-亞麻酸或其同分異構體的信號）在合煎液中缺失，進一步說明以上兩藥配伍煎煮時可能因各化學成分之間的反應，溶液pH 的變化，皂苷、鞣質等成分的影響，受熱水解等過程的影響導致組分的溶出率降低[6]。不同的是，本研究通過合煎液中增加了1 個五味子木脂素離子峰的結果，推測合煎過程也可能增加化合物溶出或使化合物發生結構轉化。

中醫理論認為，酸棗仁與五味子同具酸味，均具有養心安神、收斂固澀之功效，符合“七情和合”的組合原理；兩者配伍用量以酸棗仁為多，說明在此相須藥對中，酸棗仁為君藥，五味子為臣藥[43]。本課題組前期實驗研究表明，酸棗仁-五味子（2∶1）配伍時，具有顯著的抗焦慮作用，其抗焦慮效果優于酸棗仁、五味子單獨使用，兩者的配伍作用機制尚不明確。利用高分辨質譜技術結合質譜結構解析軟件，研究酸棗仁、五味子配伍前后化學成分的變化，為兩者配伍前后在體內吸收、分布、代謝、排泄過程的研究提供參考，有助于闡明兩者配伍作用機制，指導臨床用藥。