有機食葵仁樣品中霉菌和酵母菌檢測的重復性和實驗室內再現性分析

高 陽，盧福榮

1.歐陸食品檢測服務(大連)有限公司，遼寧 大連 116023；2.營口市食品藥品檢驗檢測中心，遼寧 營口 115000

霉菌和酵母菌是食品正常菌相的一部分，有些可用來加工食品，也可能導致食品腐敗，影響食品質量。因此評價食品衛生質量的指示菌也包括霉菌和酵母，其計數結果可用來評判食品被污染的程度。目前國內外均規定了各種對霉菌和酵母菌的檢測標準，其中平板計數法檢測結果相對精準[1]，故本試驗采用國際標準(ISO 21527—2008)中平板計數法檢測霉菌和酵母菌，并對檢測結果的精密度進行統計分析。

精密度分析可用于定量方法方法確認，也可用于實驗室內部質量監控。一個實驗室內通過一個方法確認時所獲得的質量指標包括重復性限(r)、重復性標準偏差(Sr)、重復性相對標準偏差(RSDr)、再現性限(R)、再現性標準偏差(SR)、再現性標準偏差(RSDR)[2]。本次試驗采用GB/T 6379.2—2004規定的重復性計算方法和《食品微生物檢測統計學》中的實驗室內期間再現性(本試驗采用不同分析人)推導方法對試驗結果進行重復性和實驗室內再現性統計分析，該實驗室內期間再現性推導方法是由ISO TS 19036:2006/Amd 1:2009中提出的方法改進而來的。因此本試驗所獲得的相對標準偏差用于評定實驗室內該方法確認結果，同時其重復性限和實驗室內再現性限指標亦可為日后該檢測方法的實驗室內部質量控制評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種來源

白曲霉CICC 41312，由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。釀酒酵母ATCC 9763，由廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.1.2培養基

DG18瓊脂培養基；0.1%蛋白胨水(PW)。

1.1.3試劑與儀器

霉菌培養箱：(25±1)℃；恒溫水浴鍋：(46±1)℃；電子天平：分度值0.1 g；均質器；移液器；無菌培養皿：直徑90 mm。

1.2 方法

1.2.1檢測樣品制備

本實驗選擇的樣品基質為有機食葵仁(水活度<0.95)，其自然污染水平小于10 CFU/g，使用人工污染樣品方式，添加陽性菌種白曲霉和釀酒酵母。白曲霉陽性添加量為104～105CFU/25 g；釀酒酵母陽性添加量為105～106CFU/25 g。

因微生物檢測行業標準中要求重復性的測定通常需要測定10個以上的測試樣品[3]，故本試驗采用11個測試樣品進行實驗室內重復性和實驗室內再現性試驗。

1.2.2霉菌酵母菌檢測方法

按照國際標準ISO 21527-2:2008 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 2:Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95 規定的傾注平板法檢測程序進行。

檢測過程為：

① 無菌稱取25 g樣品并加入225 mL PW，置于無菌均質袋內均質，用拍打式均質器拍打1 min，充分混合制成10-1初始稀釋液。

② 取兩塊無菌平皿。用2 mL無菌吸管分別吸取 1 mL 樣品的初始懸浮液(10-1稀釋度)加到每塊平皿中。

③ 用2 mL無菌吸管轉移1.0 mL 10-1稀釋溶液到9.0 mL無菌PW中，充分混合制得10-2稀釋溶液。

④ 另取兩塊無菌平皿，用另一支無菌吸管，分別吸取 1 mL 10-2樣品稀釋液加到每塊平皿中。

⑤ 另取一支新的2 mL無菌吸管，重復上述③操作，獲得進一步稀釋，本試驗一直稀到10-5稀釋度。每稀釋一次即換用1支新的滅菌吸管。

⑥ 試驗選取后4個連續的十倍稀釋液接種到平皿中，以期獲得生長菌落數小于150 CFU的平皿，以便計數。

⑦ 每塊平皿倒入20 mL～25 mL冷卻到 44 ℃～47 ℃的DG18瓊脂，從制備好初始懸浮液(如果是液體樣品為10-1稀釋液)向平皿內傾倒瓊脂，時間不得超過 45 min。

⑧ 采用順時針逆時針各三圈、水平和左右方向各三次的方式，將接種液體與瓊脂混合均勻，平皿放置在涼的水平面上待凝固[4]。

⑨ 將平皿正置于(25±1)℃的霉菌培養箱中，培養 5 d。

⑩ 菌落計數。選擇菌落數少于150 CFU的培養皿計數，必要時使用雙目放大鏡或顯微鏡進行檢查，以便區分酵母或霉菌和菌落中的細菌。

1.2.3重復性測量方案

1.2.3.1 重復性檢測

由操作人員A或操作人員B對11份人工污染有機食葵仁樣品進行霉菌和酵母菌計數試驗，試驗方案的描述如圖1，即對1個實驗室內一個操作人員對11個樣品的1個污染水平取兩次試驗的用量，制備初級稀釋液進行重復2次檢測，共22次測試。具體檢測方法按1.2.2 霉菌酵母菌檢測方法進行。

圖1 測算試驗實驗室內重復性的試驗方案

1.2.3.2 重復性計算[5,6]

(1-1)

(1-2)

(1-3)

1.2.4再現性測量方案

1.2.4.1 再現性檢測

由操作人員A和操作人員B分別對11份人工污染有機食葵仁樣品進行霉菌和酵母菌計數試驗，試驗方案的描述如圖2，即對1個實驗室內每個操作人員對11個樣品的1個污染水平取兩次試驗的用量，制備初級稀釋液進行重復2次檢測，共44次測試。具體檢測方法按1.2.2 霉菌酵母菌檢測方法進行。

圖2 測算試驗實驗室內再現性的試驗方案

1.2.4.2 再現性計算[6-8]

實驗室內再現性方差：

(2-1)

再現性標準偏差為獨立數據集平均方差的平方根，將方差之和除以n，即：

(2-2)

(2-3)

(2-4)

(2-5)

2 結果與討論

2.1 結果

對兩名操作人員A、B在同一天檢測的11個人工污染有機食葵仁樣品的霉菌和酵母菌計數結果進行歸納分析，詳細計算數據分別見表1和表2。

表1 11組霉菌計數數據對的重復性和實驗室內再現性計算

表2 11組酵母菌計數數據對的重復性和實驗室內再現性計算

2.1.1重復性(Sr)

2.1.2重復性限(r)

2.1.3再現性(SiR)

2.1.4實驗室內再現性限(iR)

2.2 討論

實驗室內重復性是定量分析試驗的精密度指標，指在相同的條件下(如：設備、操作者、實驗室或培養時間)對同一個樣品使用相同的方法分析獲得的一系列獨立測試結果之間的一致程度。再現性分為實驗室間再現性和實驗室內再現性。國際標準中指出實驗室內再現性是指再現性條件下單個實驗室對再現性的測量[9]。因此在試驗中得出的相對標準偏差能夠反映不同平均值的變異程度。結合霉菌和酵母菌的重復性相對標準偏差和再現性相對標準偏差結果，以表達本實驗室該方法確認結果。本試驗人工污染有機食葵仁的霉菌重復性相對標準偏差為3.07%和2.70%，內部再現性相對標準偏差為2.25%；酵母菌重復性相對標準偏差為2.00%和1.13%，內部再現性相對標準偏差為1.47%，結果均小于5%，表明本次試驗結果沒有顯著性差異。

3 結論

本試驗霉菌精密度檢測結果：分析人A重復性SrA為0.135，重復性限r為0.374；分析人B霉菌重復性SrB為0.118，重復性限r為0.328。實驗室內再現性SR=±0.099，再現性限R為0.274。

本實驗酵母菌精密度檢測結果：分析人A重復性SrA為0.105，重復性限r為0.291；分析人B重復性SrB為0.060，重復性限r為0.167。實驗室內再現性SiR=±0.078，再現性限R為0.215。