觀光木果實黃酮類成分的初步鑒定及抗氧化活性分析

羅佳 馬若克 符韻林 韋鵬練

摘?要：為探究觀光木果實純化后黃酮的純度、抗氧化活性以及黃酮類物質的結構，本文采用D101大孔樹脂和不同體積分數的乙醇對觀光木果實的黃酮類化合物進行純化，得到5個洗脫物，分別為水洗脫物、10%洗脫物、30%洗脫物、50%洗脫物和70%洗脫物，研究洗脫物黃酮純度以及對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2-聯氮-雙-3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸（ABTS）的清除能力，通過傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）進行初步結構表征，進一步使用超高效液相色譜串聯四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀聯用技術 （Q-EXCTIVE-MS）鑒定純化后洗脫物的組成和結構。結果表明，30%洗脫物黃酮純度最高，且DPPH和ABTS的清除能力最強，半抑制質量濃度分別為106.95、71.57 mg/L。傅里葉變換紅外光譜儀顯示樣品含有羥基、酚羥基、CO以及甲基等黃酮類特征官能團，對純化后的果實進行UPLC分析，共鑒定出5種黃酮類化合物，分別為4′，5，6，7-四甲氧基黃酮、三葉豆苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異金雀花素、橘皮素。DPPH和ABTS抗氧化試驗表明純化后的觀光木果實具有較好的抗氧化能力，研究可為觀光木的保護和資源利用提供一定的參考。

關鍵詞：觀光木;黃酮;傅里葉變換紅外光譜儀;抗氧化活性;化學成分

中圖分類號：S792.11?文獻標識碼：A?文章編號：1006-8023（2021）06-0053-09

Abstract：To explore the purity of flavonoids， antioxidant activity and the structure of flavonoids after purification of T. odorum fruit， D101 macroporous resin and different concentrations of ethanol were used to purify the flavonoids of the determined T. odorum fruit， and 5 eluates were obtained， namely， water eluate， 10% eluate， 30% eluate， 50% eluate and 70% eluate， the eluate flavonoid purity and the scavenging ability of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and 2， 2 -azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS） were studied. Preliminary structural characterization was carried out by Fourier infrared spectroscopy （FT-IR）， and the composition and structure of the purified eluate were further identified using ultra performance liquid chromatography mass Spectrometry （Q-EXCTIVE-MS）. The results showed that the 30% eluate had the highest purity of flavonoids and the strongest scavenging ability of DPPH and ABTS. The half-inhibitory concentrations were 106.95 mg/L and 71.57 mg/L， respectively. Fourier infrared spectroscopy showed that the sample contained characteristic functional groups of flavonoids such as hydroxyl， phenolic hydroxyl， CO and methyl. UPLC analysis of the purified fruit revealed a total of 5 flavonoids， 4 ， 5， 6， 7-tetramethoxyflavonoids， trifolin， isorhamnetin-3-O-glucoside， isoscoparin， tangeretin. The antioxidant tests of DPPH and ABTS showed that the purified T. odorum?fruit had good antioxidant capacity， which provided a certain reference for the protection and resource utilization of T. odorum.

Keywords：Tsoongiodendron odorum; flavonoids; Fourier transform infrared spectroscopy; antioxidant activity; chemical constituents

0?引言

觀光木（Tsoongiodendron odorum）又名香花木，是我國珍稀瀕危樹種，主要分布地區為廣東、廣西、海南、貴州和福建[1]。觀光木樹形優美，分枝整齊，花多而美觀，葉和果也具有一定的特色，常用于園林觀賞樹種和行道樹種[2]。其木材紋理通直，材質優良，易加工，不易開裂，多用于建筑和家具，是較好的用材樹種[3]，樹皮和根皮在民間被用于治療癌癥[4]、木材材性[8]以及群落結構[9-10]等，關于其化學成分和生物活性的研究較少。

黃酮類化合物廣泛存在于植物中，具有較強的抗氧化活性和抗炎活性，還能抑制腫瘤生長。大量研究證明木蘭科植物也具有抗腫瘤活性、抗真菌活性、抗炎活性和抗氧化活性的效果[11-14]，可供藥用。了解觀光木的化學成分對于主動保護觀光木以及開發利用藥用價值有重要的意義。因此，本研究以觀光木的果實為研究對象，采用D101型大孔樹脂和不同體積分數的乙醇進行洗脫和純化，并探究不同洗脫物的抗氧化能力，采用傅里葉紅外光譜儀對純化后的洗脫物進行初步結構表征，并進一步利用超高效液相色譜串聯四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀聯用技術（Q-EXACTIVE-MS）鑒定黃酮類化學成分，為提高觀光木的利用價值以及后續觀光木果實黃酮類化合物開發創新和分離提供一定的參考。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

觀光木果實于2019年11月采自廣西壯族自治區南寧市良鳳江國家森林公園試驗林區，將果實自然風干，用磨粉機磨碎，過40～60目篩，備用。

1.2?儀器與設備

超高效液相色譜質譜聯用儀（ Q-EXCTIVE-MS，美國熱電公司）;傅里葉變換紅外光譜儀（IRTracer-100，島津公司）;B電子天平（SA124S-CW，賽多利斯科學儀器有限公司）;粉碎機（DFT-200，溫嶺市林大機械有限公司）;可見紫外分光光度計（SP∶754，上海光譜有限公司）。

1.3?實驗方法

1.3.1?黃酮的提取與純化

采用80%乙醇回流提取3次 ，第1次5倍量提取2 h，第2次4倍量提取2 h，第3次4倍量提取2 h，提取液合并過濾濃縮至無醇味，加水稀釋至提取物的3倍，靜置過夜，400目絨布過濾，濾液上處理好的D101大孔吸附樹脂，樹脂用量為提取物的3倍。徑高比為1∶8，先用蒸餾水沖洗至無色，再分別用2倍柱體積水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇進行洗脫，分別收集洗液，真空濃縮干燥即得到不同乙醇洗脫物。

1.3.2?蘆丁標準曲線的繪制

參考王俊青等[15]研究方法。

1.3.3?純化后黃酮化合物純度的計算

取大孔樹脂純化后黃酮粉末各0.050 g 放入10 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容，得到質量濃度為5 mg/L的黃酮類化合物標準溶液;取適量黃酮溶液加入0.3 mL的5% NaNO2 溶液，搖勻，靜置6 min，再加入0.3mL的10%AlCl3 溶液，搖勻，靜置6 min，最后再加入4 mLNaOH 溶液，用70%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，在波長為510 nm 處測定上述樣品溶液的吸光度，將所得吸光度帶入建立的回歸方程中，得到純化后黃酮類物質的質量純度。

1.3.4?DPPH法測定黃酮類物質的抗氧化活性

參考何禮等[16]研究方法。取3 mL不同濃度的樣品溶液，加入3 mL的2×10-4mol/L DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），混合均勻，避光反應30 min，以無水乙醇為空白測吸光度A1;3 mL不同濃度的樣品溶液和3 mL無水乙醇的吸光度為A2; 3 mLDPPH溶液和3 mL無水乙醇的吸光度為A3，在517 nm波長下分別測其吸光度。計算IC50值，即DPPH清除率達到50%時各組分樣品的質量濃度。IC50值越小，則表示其DPPH自由基清除能力越強。

1.3.5?ABTS法測定黃酮類物質的抗氧化活性

參考王富豪等[17]研究方法。取1 mL不同質量濃度的樣品溶液，加入4 mL ABTS（2，2-聯氮-雙-3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）溶液，混合均勻，避光反應15 min，以無水乙醇為空白，吸光度為B1;1 mL不同質量濃度的樣品溶液和4 mL無水乙醇的吸光度為B2; 4 mLABTS溶液和1 mL無水乙醇的吸光度為B3，在734 nm波長下分別測其吸光度。計算IC50值，即ABTS清除率達到50%時各組分樣品的質量濃度。IC50值越小，則表示其ABTS自由基清除能力越強。

1.3.6?紅外光譜分析

取適量蘆丁和純化后樣品分別與溴化鉀混合后壓片，在500～4 000 cm-1范圍內掃描[18]。

1.3.6?超高效液相色譜-串聯質譜鑒定觀光木果實中黃酮類成分

采用Q-EXACTIVE-MS對黃酮化學成分進行鑒定。超高效液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLCBEHC18（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）。流動相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇，柱溫為30 ℃，進樣體積為1 μL，梯度洗脫見表1。

高分辨質譜條件：采用ESI 離子源;溫度300 ℃;傳輸毛細管溫度320 ℃;鞘氣206 kPa;輔助氣流速69 kPa;正離子模式下噴霧電壓為3.0 kV;掃描模式為Full MS和Full MS/dd-MS2，質量范圍100～1 000 ua，一級掃描和二級掃描分辨率分別為70 000、17 500。

1.4?數據處理

每個樣品重復3次實驗，采用IBM SPSS Statistics 19統計分析軟件計算IC50值，采用Origin繪圖。

2?結果與分析

2.1?觀光木果實總黃酮標準曲線

以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，擬合曲線，得到蘆丁質量濃度和吸光度之間的回歸方程：y=0.009 5x+0.004 1， 相關系數R2=0.999 7。

2.2?黃酮純度

觀光木果實經D101大孔樹脂和不同體積分數乙醇洗脫后得到5個洗脫物，其黃酮純度見表2。30%洗脫物中黃酮純度最高，水洗脫物黃酮純度最低，初步認為30 %乙醇對觀光木果實的黃酮類物質具有較強的富集效果。

2.3?DPPH自由基清除能力

由圖1可知，5個洗脫物對DPPH自由基均具有一定的清除作用，隨著溶液質量濃度的增加，DPPH自由基清除能力也呈增加的趨勢。由表2可知，IC50的大小依次為：水洗脫物、70%洗脫物、50%洗脫物、10%洗脫物、30%洗脫物，IC50值越小，表明清除能力越強。其中，30%洗脫物對DPPH自由基清除能力最強，觀光木果實黃酮質量濃度為16.67～216.67 mg/L，隨著溶液質量濃度的增加，清除DPPH自由基能力加強，當溶液質量濃度為183.33 mg/L時清除率達到70.15%。

2.3?ABTS自由基清除能力

由圖2可知，5個洗脫物對ABTS自由基的清除能力隨著溶液質量濃度的增加而增加。10%洗脫物、30%洗脫物、50%洗脫物對ABTS自由基具有較強的清除能力，IC50分別為62.54、71.57、75.29 mg/L（表2），均表現出較強的ABTS自由基清除能力。其中，30%洗脫物對ABTS自由基表現出較強的抗氧化活性，溶液質量濃度為25～200 mg/L，隨著溶液質量濃度的增加，清除ABTS自由基的能力也增強，當溶液質量濃度為200 mg/L時，觀光木果實總黃酮對ABTS自由基的清除能力高達92.10%。

2.4?觀光木果實黃酮類化學成分初步鑒定

2.4.1?紅外光譜分析

紅外光譜通過樣品吸收譜帶的位置、形狀和強度等，來推測官能團的種類[19]。圖3為蘆丁和觀光木果實黃酮類物質純化產物的紅外光譜，標準品蘆丁和樣品分別在3 428.3、3 427.5 cm-1出現寬而強的吸收峰，為O—H的伸縮振動，表明有酚羥基的存在[20];蘆丁在2 938.4 cm-1處，樣品在2 927.9 cm-1處均有一個強度較小的吸收峰，為亞甲基的C—H的反對稱伸縮振動峰，說明飽和碳上的氫較少;1 654.1～1 457.8 cm-1為蘆丁標準品的苯環的骨架震動特征吸收峰分布區域，樣品在1 656.9 cm-1和1 504.5 cm-1處有吸收峰，表明樣品可能存在苯環;蘆丁樣品在1 500～1 300 cm-1均出現一些特征峰，這屬于O—H的彎曲振動峰;1 300～1 200 cm-1屬于CO的伸縮振動吸收峰，蘆丁和樣品有出現一定的特征峰。依據以上推斷，初步判斷觀光木果實中的黃酮主要為黃酮醇類，具體的結構需要進一步進行UPLC-MS/MS檢測。

2.4.2?UPLC-MS-MS法鑒定黃酮類物質成分

為了探討觀光木果實中具有抗氧化作用的主要化學成分，本文進一步對黃酮純度較高和抗氧化活性較強的30%洗脫物進行了UPLC-MS-MS分析。根據保留時間、質譜圖的碎片斷裂模式、軟件（Compound discoverer 3.1）的對比分析以及參考文獻，推斷出的5種黃酮類物質的結構，這些化合物可能是觀光木果實具有較好清除DPPH和ABTS自由基的活性物，結果見表3。

表3中的幾種化合物的分子結構如圖4所示。

化合物1準分子離子峰[M+H]+m/z 343.172 9，分子式為C19H18O6，二級質譜碎片有[M+H-O]+m/z 327.119 7， [M+H-2CH3-CO]+m/z285.111 7，根據文獻[21]及質譜數據庫推斷化合物1可能為4′，5，6，7-四甲氧基黃酮。

化合物2準分子離子峰[M+H]+m/z 449.107 9，推斷分子式為C21H20O11，二級質譜碎片離子有[M+H- C6H11O5]+m/z 287.054 6，[M+H- C6H11O5-OH]+m/z 270.075 6，再根據文獻[22]報道，推斷為三葉豆苷。

化合物3準分子離子峰[M+H]+m/z 479.118 4，推斷分子式為C22H22O12，二級質譜特征碎片離子為 [M+H- C6H11O5]+m/z ?317.065 4，通過與mzcloud（賽默飛-未知物鑒定的新型數據庫）質譜數據庫和參考文獻[23]對比，化合物3被鑒定為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

化合物4在高分辨質譜下的準分子離子峰[M+H]+m/z 463.123 5，推斷分子式為C22H22O11，二級質譜特征碎片離子為 [M+H- C6H11O5]+m/z ?301.070 4，結合文獻報道[24]，推斷為異金雀花素。

化合物5在高分辨質譜下的準分子離子峰[M+H]+m/z 373.124 3，推斷分子式為C20H20O7，二級質譜碎片離子有 [M+H- CH3]+m/z ?358.1040，[M+H- 2CH3]+m/z ?343.080 8，[M+H-2CH3-O]+m/z ?327.085 8，結合文獻[25]報道，推斷為橘皮素。

3?結論

本文利用D101型大孔樹脂和不同體積分數的乙醇純化觀光木果實的黃酮，得到5個洗脫物，發現不同洗脫物的黃酮純度和抗氧化活性均存在一定的差異，其中，30%洗脫物的黃酮純度最高，水液洗脫物最低。5個洗脫物DPPH和ABTS的抗氧化活性均隨著溶液質量濃度的增加而逐漸增加，30%洗脫物對二者的清除能力最強，最大清除率分別達到70.15%和92.10%，表明觀光木果實總黃酮具有較強的抗氧化活性。通過FT-IR進行了初步的結構表征，觀光木果實提取物以羥基、酚羥基、羧基以及甲基為主。用UPLC-MS/MS進一步推斷了出觀光木果實的黃酮中可能含有4′，5，6，7-四甲氧基黃酮、三葉豆苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異金雀花素、橘皮素。

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