高原低氧下機體鐵代謝變化及其對紅細胞生成的影響※

李美琦綜述 駱倩倩審校

(南通大學特種醫學研究院低氧生物醫學綜合實驗室，江蘇 南通 226019)

高原紅細胞增多是一種典型的慢性高原病，特點是紅細胞的大量生成及累積。鐵是紅細胞合成的重要原料，在正常情況下機體的鐵穩態處于平衡狀態，但是在高原低氧環境下，鐵代謝發生明顯改變，機體鐵穩態被打破并顯著影響紅細胞生成。本文圍繞低氧對機體鐵代謝的影響和高原低氧下機體鐵代謝的變化對紅細胞生成的影響進行綜述。

1.高原低氧的適應

缺氧誘導因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是氧穩態的主要調節者，也是誘導低氧基因和修復細胞內氧環境的核心調節因子[1]。HIF是由受氧濃度誘導型表達的HIF-α亞基和組成型表達的HIF-β亞基組成的異源二聚體[2]，其中HIF-α有3個亞型(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)并分別由三個獨立的基因(HIF1A、EPAS1和HIF3A)編碼，HIF-β只有一種亞型。HIF-1α和HIF-2α以不同的方式與DNA結合，參與紅細胞生成的途徑的調控。通常認為HIF-1α參與急性缺氧反應而HIF-2α參與慢性缺氧反應。目前關于HIF-3α的研究較少。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶(Prolyl hydroxylase，PHD)可以將氧氣、亞鐵和α-酮戊二酸作為底物，在氧依賴性降解域內對HIF-α亞基進行羥基化，羥基化的HIF-1α被pVHL識別，隨后募集E3泛素連接酶對其復合物進行泛素化[3]，最后經過蛋白酶體降解途徑被降解[4]。在低氧環境中，PHD處于抑制狀態，HIF-α可與細胞質中的熱休克蛋白90結合使HIF-α穩定，經過HIF-α的C端的核定位信號的協助，使其轉移至細胞核內，與HIF-β形成異源二聚體發揮轉錄因子調節功能。當HIF結合到靶基因低氧反應原件(HRE)上時，募集轉錄共激活因子CBP/p300來激活相關靶基因[包括促紅細胞生成素(EPO)[5]]刺激骨髓生成新的紅細胞；增加血管內皮生長因子的表達，促進血管生成增加供血；增加無氧酵解過程中相關基因(PDK1、LDHA、GLUT1等)的表達，以對低氧作出適應性反應[6]。PHD具有3個亞型，其中PHD1主要位于細胞漿，PHD2主要位于細胞核，而PHD3在胞漿和胞核都存在。PHD作為HIF-α氧傳感器的調節劑，其活性也受細胞內氧濃度的控制。

雖然高海拔低氧環境容易導致高原病的發生，然而一些久居高原人群卻對高原環境表現出了獨特的適應性。研究表明藏族人群特有的HIF-2α(又稱EPAS1)[7]、PHD2(又稱EGLN1)[8]和血紅素加氧酶2(HMOX2)[9]基因均有不同于漢族人群的突變，正是這些遺傳基因的突變阻止了藏族人血紅蛋白濃度的過度升高，降低了各種高原性疾病發生的可能性。但無論是EPAS1、EGLN1，還是HMOX2，都是通過降低藏族人血液中的血紅蛋白的量來使藏族人適應低氧環境。而急進高原者或移居者在這些基因沒有發生突變的情況下是如何適應高原低氧環境的具體機制尚不清楚。

2.高原低氧對鐵代謝的影響

在高原低氧暴露時，機體正是通過調節或影響鐵調素(Hepcidin，Hepc)、鐵輸出蛋白(Ferroportin，Fpn)、轉鐵蛋白(Transferrin，Tf)、轉鐵蛋白受體(Transferrin Receptor，TfR)、鐵蛋白(Ferritin，Ft)、二價金屬離子轉運體1 (Divalent metal transporter l，DMT1)這些鐵代謝相關蛋白的表達實現對機體鐵代謝穩態的調節，從而保證高原暴露情況下新的血紅蛋白生成對鐵的需求。

2.1 高原低氧對Hepc的影響

Hepc是由肝臟合成并分泌的富含半胱氨酸的25個氨基酸的抗菌多肽，以抑制鐵超載或炎癥來調節全身鐵穩態。它可以影響腸道鐵吸收、巨噬細胞鐵釋放以及肝臟鐵存儲。Hepc的主要作用方式是通過結合其受體蛋白——膜鐵轉運蛋白Fpn來實現的。Hepc與細胞膜上的Fpn結合可引起Fpn內化，形成內吞小體后與溶酶體融合并在其中被降解[10]。在巨噬細胞、腸上皮細胞和肝細胞中Fpn的表達量很豐富，因此在這些細胞中Hepc的調節作用最為顯著。Hepc正是通過調節這三個組織部位的Fpn的量來調節機體中的鐵穩態。機體在發生應激紅細胞生成和缺氧、生長、妊娠等條件下，通過抑制Hepc的生成，促進外周鐵增加以滿足機體對鐵的需求[11]。低氧下的相關研究表明，HIF-1α可以通過直接與Hepc的啟動子結合來抑制Hepc的表達[12]。后來又有研究指出，在缺氧條件下由于紅細胞生成的增多引起紅鐵酮(EFRE)的表達增多，而EFRE可以抑制Hepc的產生，當體內鐵充足時，紅細胞的生成速度不受影響，紅細胞數量增多，未成熟的紅細胞生成并分泌EFRE以抑制Hepc，使Fpn正常釋放儲存鐵，以供應紅細胞的生成[13]。另外，HIF-2α也被證明可以通過促進EPO的表達致紅細胞數增多來抑制Hepc的表達[14]。高海拔情況下，嚴重的能量不足也會抑制Hepc表達，但是在高原肺水腫患者中它是增加的[15]。

2.2 高原低氧對Fpn的影響

Fpn是一種含有12次跨膜結構域的蛋白，是目前已知唯一的膜結合鐵輸出蛋白，它的主要功能是負責將細胞內的鐵從細胞內輸出到細胞外。Fpn僅在幾種類型細胞中表達，包括巨噬細胞、腸上皮細胞、肝細胞和乳腺上皮細胞[16]，并可將鐵釋放到血漿中，經過轉鐵蛋白的運輸，參與紅細胞的生成。脾臟巨噬細胞在從受損或衰老的紅細胞回收鐵的過程中起主要作用，并通過巨噬細胞膜表面上的Fpn將從血紅蛋白上回收的鐵輸出至血漿中供機體循環利用[17]。因此細胞表面上的Fpn數量直接決定了鐵的輸出量。高原低氧對Fpn的影響主要是通過Hepc間接產生的[18]。早前的一項研究表明HIF-2α可以調節Fpn mRNA的表達，但是最近的研究證實，在小腸中，Fpn通過控制細胞鐵輸出調節鐵依賴PHD的活性，可以穩定和激活HIF-2α[19]。

2.3 高原低氧對Tf及TfR的影響

Tf是鐵的運載載體，在血漿中以三價鐵結合態和未結合態形式存在[20]，游離鐵一旦進入血液就會與Tf結合，通過血液將鐵輸送到全身各處。到達需鐵的細胞后通過TfR介導攝入。TfR識別含鐵Tf后，發生網格蛋白依賴性內吞，形成內吞小體，隨后通過內吞小體膜上的DMT1將鐵釋放到細胞內，進入胞內的鐵可通過Fpn輸出細胞，多余的鐵則被存儲到鐵蛋白Ft-L上[21]。通過TfR吸收與Tf結合的鐵是大多數細胞中鐵的主要來源[22]。但是也有研究認為，TfR還可介導Tf和H-鐵蛋白(Ft-H，一種鐵儲存蛋白)的攝取[23]。血清Tf在肝臟、脾臟、腎臟和樞神經系統中均有合成[24]。Tf的功能對于調節胚胎生長、細胞生長、細胞凋亡、葡萄糖代謝和運動、增殖、分化至關重要。TfR的表達受細胞內鐵水平的影響強烈：鐵缺乏時TfR的合成被激活，充足時則相反。因此，在大多數細胞中鐵的攝取水平通過調節TfR的表達實現[25]。有研究認為，TfR2/HFE復合物被認為可激活Hepcidin的轉錄[26]。同時，TfR2與促紅細胞生成素受體(EPOR)的復合物會使細胞表面的EPOR更加穩定，而缺少TfR2會導致人類紅系祖細胞的終末分化延遲，且會增加紅系前體細胞的EPO敏感性[27]。另外，有研究認為HIF可通過與TfR啟動子中的特定低氧反應元件結合誘導TfR基因轉錄。在Hep3B人肝癌細胞中，在1% O2或模擬缺氧下經CoCl2處理，TfR mRNA增加了3倍[28]，顯示低氧可以誘導TfR基因的轉錄。

2.4 高原低氧對Ft的影響

Ft是在各組織細胞中廣泛存在的主要的鐵存儲蛋白，對鐵的穩態至關重要。Ft基因在所有動物細胞中均有表達[29]，Ft有兩種亞基類型，分別為H型和L型，即Ft-H和Ft-L。這兩個亞基的比例隨組織類型的不同而有很大差異[30]。組織鐵蛋白H亞基主要存在于心臟和腎臟中，L亞基主要存在于肝臟和脾臟中。Ft有助于正常的鐵流動，當機體鐵含量降低時，通過機體組織中核受體共激活因子4(NCOA4)對Ft的H亞基的識別，將Ft帶入溶酶體途徑降解，釋放其結合的鐵到胞漿再通過Fpn輸出細胞供機體利用[31]。當暴露在高原低氧環境時，機體組織細胞內Ft-L的表達顯著降低，以保證將其儲存的鐵用于造血。研究表明，低氧條件下機體產生ROS時Ft-H與Ft-L會聚集，在使用抗氧化劑后聚集作用減弱，這表明Ft-H與Ft-L的聚集可能是機體抵抗ROS的一種保護方式[32]。

2.5 高原低氧對DMT1的影響

DMT1是一種在哺乳動物中廣泛表達的一種金屬離子轉運體，參與機體內二價金屬離子的轉運。食物中的鐵以兩種主要形式存在：血紅素鐵和非血紅素鐵，這兩種形式的鐵都可以被十二指腸吸收。但是大多數飲食中的非血紅素鐵是三價鐵配合物，因此食物中的非血紅素鐵在達到十二指腸后，首先用腸上皮細胞頂端膜上的十二指腸細胞色素b(DCYTB)將食物中的Fe3+還原為Fe2+后，再被膜上的DMT1轉入到腸上皮細胞內[33]。DMT1屬于可溶性載體家族成員，由于DMT1的表達對維持全身和細胞鐵穩態至關重要，因此，全身和細胞鐵水平的變化均可直接或間接控制DMT1的表達。當全身性鐵需求增加時，十二指腸中DMT1 mRNA和蛋白的表達增加，可促進更多的鐵被吸收[34]。研究證實，低氧下DMT1表達增加的機制主要是通過HIF-1結合DMT1上的低氧反應元件促進其轉錄增加蛋白表達實現的。

3.高原低氧下鐵代謝改變對紅細胞生成的影響

低氧情況下機體對鐵的需求增加，且具有一定的海拔高度和暴露時間的依賴性[35]。多項研究認為，機體在低氧下的鐵代謝相關蛋白發生明顯變化，如DMT1、TfR表達顯著升高，Ft、Hepcidin表達顯著下降[36，37]。上述結果顯示，低氧下的鐵穩態被打破后，鐵攝取及鐵轉運增加，儲存鐵釋放增加。對平原正常人群的研究發現，在剛進入高原的早期，腸道內的鐵吸收增加，之后紅細胞數量增加，在6個月之后，鐵的利用率依舊很高；對高原世居居民的研究發現，他們對鐵的利用率比平原正常人群高約30%，當人們從高原轉移到平原后鐵的利用率明顯下降[38]。這提示鐵的利用率與紅細胞生成關系密切。研究二十五位健康的登山者的血清發現，高原暴露后的血清Hepc水平降低、十二指腸鐵吸收及運輸上調[39]。另外，由于Tf、Fpn、DCYTB鐵調節蛋白(IRPs)等鐵代謝相關基因上均含有HRE，在低氧引起HIF增加后這些鐵代謝相關蛋白基因表達均有明顯增加[40]。

機體內鐵的含量顯著影響紅細胞的生成，紅細胞在骨髓中分化時通過TfR介導的Tf的內吞作用攝取鐵供應血紅蛋白合成。紅細胞在生成期間TfR表達持續增加，但在網狀細胞釋放后被下調，在成熟紅細胞中則檢測不到TfR。Tf的缺失可抑制EPO生成，導致儲存器官中的鐵積累，這表明紅細胞發育成熟中需要TfR介導的鐵攝入，Tf與TfR在EPO生成中至關重要。

有研究表明，當給予HIF穩定劑二甲基草酰甘氨酸(DMOG)時，能夠誘導巨噬細胞由M1型向M2型轉變[41]，而在低氧后巨噬細胞也表現出相同的變化[42]。雖然眾所周知M1型被認為是促炎型巨噬細胞，M2型被認為是抑炎型巨噬細胞。但是研究發現M2型巨噬細胞可以誘導HMOX1的表達并上調Fpn，使血紅素的氧化降解加快，促進衰老紅細胞的清除并促使鐵有效的被循環利用[43]。提示，低氧可能通過誘導巨噬細胞表型的轉變而對鐵的回收再循環利用產生重要影響。近期還有研究表明，低氧刺激致HIF被激活，有利于巨噬細胞對亞馬遜利什曼原蟲的吞噬[44]，隨后另一項研究也得到了相同的結論[45]。然而也有研究表明，在高原低氧條件下，小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力是下降的[46]。這其中的差異可能源自不同的低氧條件。低氧暴露是否影響了巨噬細胞的活性或數量目前尚不清楚。

近年來研究人員發現了一種新的細胞死亡方式—鐵死亡，這是一種以大量鐵離子累積為特點的新型細胞死亡方式，在鐵和酶的催化下，細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化可誘導細胞發生鐵依賴性死亡[47]。有研究表明在低氧環境下人體活性氧族(ROS)、丙二醛(MDA)水平增加，與鐵死亡相關的蛋白變化明顯[48]。另外研究還發現，在低氧條件下，肺泡巨噬細胞的超氧化物歧化酶(SOD)總量明顯上升，且巨噬細胞由M1向M2型轉變[49]；骨髓間充質細胞在給予去鐵胺(DFO)螯合鐵后，HIF-1α/環氧化酶2(COX-2)通路被激活，巨噬細胞也會由M1型向M2型轉變[50]。由骨髓巨噬細胞定向誘導為M2型巨噬細胞后，在低氧條件下其SOD1、SOD2和HMOX1及谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)水平均呈明顯下降趨勢，復氧時有所回升。這提示低氧會引起M2型骨髓巨噬細胞的抗氧化能力降低，組織巨噬細胞在處理回收鐵后，由于胞內增加的鐵含量和抗氧化力的降低，極易誘發鐵依賴性的鐵死亡。但高原低氧暴露后組織巨噬細胞是否發生鐵死亡及其對紅細胞的生成及清除能力的影響還有待進一步深入探究。雖然目前對于高原低氧是如何致巨噬細胞功能改變并引起鐵代謝改變的機制尚不清楚，但可以明確的是，在高原低氧狀態時巨噬細胞功能發生了改變，這些改變可影響鐵代謝的穩態并影響紅細胞的生成。

4.展望

機體通過復雜而又精確的機制維持鐵穩態，以滿足紅細胞生成以及其他細胞功能對鐵的需求。高原低氧環境在多個層面和分子水平影響機體鐵代謝相關蛋白表達及鐵的吸收、存儲與循環再利用的過程。高原低氧暴露可引起紅細胞數的顯著增加，導致高原紅細胞增多癥。鐵代謝紊亂是否是低氧條件下直接引起紅細胞增多癥發生發展的原因？我們近期關于高原低氧暴露對脾臟功能的研究也揭示低氧暴露可顯著抑制脾臟紅髓巨噬細胞的數量和吞噬能力，是否是高原低氧暴露后巨噬細胞的鐵過載影響了其數量及吞噬能力還需要通過進一步的研究去證實。