保健品中42種非法添加物的HPLC-MS/MS法快速篩選和測定

李亞慶，陳深樹，鐘超群，康 剛，焦臺風，董成高，楊宇航，程良紅

廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳518003

我國保健品行業(yè)發(fā)展起始于20世紀80年代，改革開放之后，國民經(jīng)濟水平不斷提高，人們對保健品的需求有所上升。20世紀90年代至21世紀初，由于監(jiān)管寬松、高利潤等特點，保健品行業(yè)飛速發(fā)展［1-3］。近年來，隨著互聯(lián)網(wǎng)經(jīng)濟的發(fā)展和消費升級的觀念不斷深入人心，加上國人固有的中醫(yī)保健思想，保健行業(yè)迎來又一個高速發(fā)展階段，整體市場趨向于更加精細化、更加高品質。行業(yè)利好背景下，監(jiān)管新政不斷出臺，推動行業(yè)規(guī)范化發(fā)展。

因筆者所屬行業(yè)的特殊性，了解到目前保健品中非法添加化學物質的問題比較突出。這些非法化學添加物質主要有6大類［4-6］：減肥類，代表性物質為西布曲明，有增加心臟病的風險，國家已明令禁止生產(chǎn)和使用；降糖降脂類，代表物質為鹽酸丁二胍，易導致乳酸堆積，在我國未獲得藥監(jiān)部門批準生產(chǎn)和使用；降壓類，代表性物質為尼群地平，超量攝取后可發(fā)生心力衰竭和心肌梗死；止咳類，代表性物質有可待因，位于《麻醉藥品品種目錄》第111號，長期攝入會產(chǎn)生耐受性和成癮性；精神類，代表性物質為扎來普隆，屬于國家特殊管制的第二類精神藥品；壯陽類，以添加西地那非為代表的壯陽類保健品在市場上最常見，非法添加易導致心源性猝死和腦出血［7-9］。現(xiàn)有非法添加化學物質的檢測方法主要有：拉曼光譜法［10-11］、高效液相色譜法［12-14］、薄層色譜法［15-16］、近紅外光譜法［17-18］以及液相色譜-質譜聯(lián)用法［19-21］等，高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質譜法［22］和高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱質譜法［23］，但可篩選的化學添加物質數(shù)量有限。近些年來國家食品藥品監(jiān)督管理總局不斷出臺關于保健品非法添加的補充檢驗方法，但是隨著不法分子對添加物質和添加手段不斷改進，現(xiàn)行方法覆蓋范圍難以滿足市場上保健品非法添加的檢測要求。同時，近些年隨著儀器檢測技術不斷發(fā)展，對保健品中非法添加的檢測報道日益增多，但是筆者檢索近幾年國內(nèi)文獻，能同時高通量快速檢定數(shù)10種非法化學物質的報道較少。

鑒于此，本文在現(xiàn)行國家標準基礎上選擇了6大類42種保健品中常見的非法添加的化學物質作為目標物，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，選用多反應監(jiān)測模式，建立了一套覆蓋范圍廣、耗時少、準確度高的高通量篩查和定量分析保健品中42種非法添加化學物質的方法，參考相關國家標準的方法并用于實際樣品檢測，出具司法鑒定意見書，檢測結果均被辦案機關依法采信。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC20A高效液相色譜儀（日本島津公司），LCMS-8045三重四級桿液相色譜質譜聯(lián)用儀、Labsolutions LCMS集合型工作站軟件（日本島津公司），Millipore Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），AUW220D型電子分析天平（日本島津公司），Cenece＠ΤDZ5-WS離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器公司），KQ-250DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

鹽酸西布曲明（純度99.9%），鹽酸N-單去甲西布曲明（純度97.7%），鹽酸N，N-雙去甲西布曲明（純度94.4%），鹽酸氯卡色林（0.1 mg/mL甲醇溶液），酚酞（純度99.8%），鹽酸二甲雙胍（純度99.9%），鹽酸苯乙雙胍（純度99.7%），辛伐他汀（純度99.5%），瑞格列奈（純度99.8%），鹽酸羅格列酮（純度93.3%），格列齊特（純度99.9%），格列喹酮（純度99.5%），卡托普利（純度99.7%），苯磺酸氨氯地平（純度100.0%），尼群地平（純度99.4%），非洛地平（純度99.6%），鹽酸哌唑嗪（純度99.9%），鹽酸可樂定（純度100.0%），鹽酸氯丙那林（純度99.9%），鹽酸二氧丙嗪（純度99.8%），扎來普隆（純度100.0%），丁丙諾非（0.1 mg/mL甲醇溶液），硝苯地平（純度99.9%），煙酸（純度99.8%），麻黃堿（1.0 mg/mL甲醇溶液），可待因（1.0 mg/mL甲醇溶液），福爾可定（純度99.3%），鹽酸氟西汀（純度99.3%）等標準品均購自中國食品藥品檢定研究院；奧利司他（純度99.8%），鹽酸丁二胍（純度99.9%），甲苯磺丁脲（純度99.6%）等標準品均購自美國Cerilliant標準品公司；西地那非（純度98.0%），豪莫西地那非（純度99.8%），枸櫞酸羥基豪莫西地那非（純度99.4%），那莫西地那非（純度99.9%），紅地那非（純度99.9%），那紅地那非（純度99.7%），偽伐地那非（純度99.8%），鹽酸伐地那非（純度99.9%），硫代艾地那非（純度99.9%），他達拉非（純度99.8%），氨基他達拉非（純度99.9%）等標準品均購自英國LGC標準品公司；甲醇、乙腈均為色譜純，購自德國Merck公司；甲酸、乙酸銨均為質譜純試劑，購自百靈威試劑公司；實驗用水為超純水。

實際樣品來源于深圳市龍華區(qū)某派出所、深圳市寶安區(qū)某派出所和深圳市某海關依法查獲或扣留送檢的保健品。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取42種非法添加化學物質標準品10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配置成1 mg/mL的標準儲備液；用甲醇稀釋至1μg/mL于-20℃避光保存；再用甲醇配制成不同濃度的標準工作液，供上機使用。

1.3 樣品處理

準確稱取樣品約10 mg，置于15 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL甲醇，超聲萃取30 min，冷卻至室溫，3 500 r/min離心3 min，取上清液1 mL通過0.22μm濾膜，濾液在50℃下使用高純氮氣吹干，用200μL甲醇復溶，轉移至樣品瓶，供高效液相色譜-串聯(lián)質譜（high-performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測。

1.4 基質混標溶液配制

取空白樣品，按1.3所述方法制備空白基質溶液，上機前使用空白基質溶液稀釋42種化學物質混合標準溶液，制成基質混合標準溶液。

1.5 HPLC-MS/MS條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Restek-UltraⅡPFPP（100 mm×2.1 mm，5μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：1.0μL；流動相：A為20 mmol/L乙酸銨和0.1%（體積分數(shù)）甲酸緩沖水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序（體積分數(shù)）：0～3min，10%～20%B；3～8 min，20%～75%B；8～10 min，80%～95%B；10～12 min，10%B。

1.5.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；霧化器流速：3 L/min；干燥器流速：10 L/min；加熱氣流速：10 L/min；接口電壓：4 000 V；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃。對碰撞能量（CE）、Q1 Prerod偏差電壓和Q3 Prerod偏差電壓等質譜條件優(yōu)化，保健品中常見42種非法添加化學物質的多反應監(jiān)測模式（reaction monitoring mode，MRM）參數(shù)如表1所示。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本研究考察了填充料為十八烷基鍵合硅膠的Agilent Poroshell 120 EC-C18液相色譜柱和填充料為五氟苯基丙基鍵合物的Restek-UltraⅡPFPP液相色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者不論在分離效果和峰形上均優(yōu)于前者，由于極性化合物或者疏水作用類似的物質的分離在C18柱上保留較弱，而PFPP柱分子中含有5個氟原子，具有較強的氫鍵作用力和陽離子交換作用力，因此本研究選用Restek-UltraⅡPFPP液相色譜柱。為提高各待測物的分離效果，保證檢測靈敏度，選用1.5.1所述的梯度洗脫方法，得到的42種化學物質的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 42種化學物質的總離子流圖Fig.1 Τotal ion chromatograms of 42 kinds of substances

2.2 質譜條件優(yōu)化

質譜條件的優(yōu)化主要是確定各化學物質的母離子、子離子以及選擇合適碰撞能量等。在本研究中，筆者借助安捷倫科技提供的Agilent MRM Database工具，查詢化學物質的母離子和子離子并做記錄。取1μg/mL的混合化學物質標準溶液直接進樣進行母離子掃描，獲取各化學物質母離子，然后通過子離子掃描方式獲取其子離子，與記錄中的各母離子和子離子做對比，選取合適子離子做MRM參數(shù)優(yōu)化以確定Q1 Prerod偏差電壓、Q3 Prerod偏差電壓和碰撞能量，結果如表1所示。

表1 42種化學物質的動態(tài)多反應模式監(jiān)測參數(shù)Τab.1 Optimized MRM parameters of 42 kinds of substances

2.3 方法驗證結果

2.3.1 線性方程、檢出限和定量限 按1.4所述方法配制系列基質混合標準溶液，以各化學物質的色譜峰峰面積（y）對進樣質量濃度（x，ng/mL）進行回歸計算，考察42種化學物質的線性關系，線性回歸方程及相關系數(shù)（r2）如表2所示。結果表明，42種化學物質在10～1 000 ng/mL質量濃度范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)r2均在0.990 3～0.999 7。在空白樣品中添加系列質量濃度的混合標準溶液，記錄信噪比為3∶1及10∶1時的濃度為檢出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantification，LOQ）。結果表明，42種化學物質的LOD為0.5～10 ng/g，LOQ為1～50 ng/g，能夠滿足非法化學添加物質的檢測要求。

表2 42種化學物質的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Τab.2 Linear equation，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation of 42 kinds of substances

2.3.2 回收率、精密度和穩(wěn)定性 以空白樣品為基質，分別選取低質量濃度（30 ng/g）中質量濃度（600 ng/g）和高質量濃度（1μg/g）3個水平的混合標準溶液，按優(yōu)化后的實驗條件，每個水平做6次平行實驗，連續(xù)3 d。結果顯示，在空白基質中所有化學物質的回收率相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于15%，滿足精密度要求。42種化學物質的平均回收率為80.59%～136.76%，3個水平下回收率正態(tài)分布曲線如圖2所示，RSD為0.41%～13.44%，方法的隨機誤差滿足測定要求。

圖2 三個水平下回收率正態(tài)分布曲線Fig.2 Normal distribution curves of recovery at three levels

選取1μg/g混合標準溶液，在統(tǒng)一實驗條件下連續(xù)10次平行實驗以評價方法穩(wěn)定性，分別計算保留時間和出峰面積的相對標準偏差。結果表明，42種化學物質保留時間RSD為0.059%～0.287%，峰面積RSD為0.536%～2.640%，方法穩(wěn)定性理想。

2.4 實際樣品檢測

按照上述方法，分別對深圳龍華區(qū)某派出所依法查處的4份保健品和深圳寶安區(qū)某派出所依法查處的3份保健品，以及深圳某海關依法扣留的8份保健品進行測定并出具司法鑒定意見書。結果表明，深圳龍華區(qū)某派出所依法查處的4份保健品中，3份檢出他達拉非，定量結果分別為5.5、9.4和7.9 mg/g；深圳寶安區(qū)某派出所依法查處的3份保健品中，其中2份分別檢出西布曲明和酚酞，定量結果分別為74.7和586.0 mg/g；深圳某海關依法扣留的8份保健品中，1份檢出為氟西汀，定量結果為18.6 mg/g，以上結果均被辦案機關依法采信。空白基質混合標準溶液（spiked sample，1μg/mL）與實際陽性樣品（actual sample）的MRM色譜圖和質譜圖如圖3所示。可見，在保健品行業(yè)非法添加化學物質的情況仍存在，相關部門應加強監(jiān)管力度，嚴控保健品生產(chǎn)過程，保證產(chǎn)品質量，保障消費者安全。

圖3 空白基質混合標準溶液（1μg/mL）和陽性樣品的MRM色譜圖和質譜圖：（a）酚酞，（b）西布曲明，（c）他達拉非，（d）氟西汀Fig.3 MRM chromatograms and mass spectra of spiked samples（1μg/mL）and actual samples：（a）phenolphthalein，（b）sibutramine，（c）tadalafil，（d）fluoxetine

3 結 論

本研究建立了HPLC-MS/MS快速篩選和測定保健品中42種非法添加化學物質的分析方法。該方法樣品前處理簡便，分析覆蓋范圍廣、耗時少、準確度高，能滿足對保健品中非法添加物質的測定要求。在實際樣品的檢測中，按照本方法對深圳市辦案機關送檢的保健品檢測，非法添加的化學物質均被準確篩查和定量檢測并出具司法鑒定意見書，所有送檢樣品的檢測結果均被辦案機關依法采信。本方法為保健品中多種非法添加化學物質的定性篩查和定量分析提供了高效、可靠的檢測方法。