circRNA在骨骼肌中的研究進展

向婭，柴志欣，武志娟，鐘金城，信金偉

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室，成都610041;2.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩850000)

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類不具有5'端帽子和3'端poly(A)尾巴的共價閉合的環形RNA分子，由pre-mRNA經過反向剪接(backsplicing)形成。circRNA最早于1976年被偶然發現，該類病毒RNA無法在其5'或3'末端進行酶標記，也無法被蛇毒磷酸二酯酶降解。1979年，Hsu等［1］利用電子顯微鏡鑒定出一些在真核細胞質中具有環狀結構的RNA分子，但由于它們豐度低且不常見的特征，在隨后的幾十年這類RNA均被認為是剪接錯誤的產物，并未引起廣泛關注。隨著高通量測序技術和生物信息學技術的快速發展，2012年首次報道通過RNA-Seq方法鑒定了約80個circRNAs，circRNA才正式進入科學家的視野。隨后科學家們先后在人［2］、豬［3］、牛［4］等物種上發現了circRNA。近年來，大量的研究表明circRNA在生物的生長發育、疾病發生和發展等方面發揮重要作用。本文就circRNA的形成機制、生物學功能及其在動物骨骼肌形成中的功能研究進行概述，以期為今后探索circRNA在動物骨骼肌中的功能及分子機制提供參考。

1 circRNA的形成機制

circRNA是經過轉錄后由上游3'剪接位點和下游5'剪接位點反向剪接形成，沒有自由5'末端帽子和3'末端poly(A)尾的共價閉合環形分子［5，6］。因核酸外切酶無法識別這種特殊的結構而不易降解，從而確保了circRNA的穩定性。circRNA可來源于基因組的任何區域，長度從幾百到幾千個核苷酸不等。根據circRNA分子的基因來源，主要分為3類，外顯子circRNA(circular exonic RNA，ecirRNA)、內含子circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)、外顯子-內含子circRNA(exon-intron circRNA，EIciRNA)。研究者認為不同circRNA的形成受不同的剪接機制調控，而以上3種類型的circRNA在其功能上是否會有所不同，有待進一步研究。

外顯子環狀RNA最豐富，主要存在于細胞質中。其形成機制有兩種，直接反向剪接和外顯子跳躍，這兩種形成機制與經典剪接體相關，但直接反向剪接可能比外顯子跳躍發生的更頻繁。EIciRNA是circRNA的特殊亞型，在哺乳動物細胞中被發現，當兩個以上的外顯子在環化時，它們之間的內含子可能滯留其中，形成既有外顯子又有內含子的EIciRNA［7］。有研究表明，EIciRNA的形成機制可能與ecircRNA相似，但內含子保留的機制尚不清楚。內含子環狀RNA主要存在于細胞核中，在釋放5'外顯子后，末端3'-OH攻擊3'剪接位點，生成ciRNA并釋放3'外顯子［8］。研究發現，部分內含子在剪接作用中會形成套索結構，但很快被脫分支降解［9］。作為一類特殊的內含子circRNA，tricRNA(tRNAintroniccircRNA)是由pre-tRNA剪切后形成的［10］，tricRNA形成必須含有保守的tRNA序列基序和加工酶。

2 circRNA的生物學功能

circRNA主要存在于細胞質或外泌體中，具有組織、疾病、時序、發育階段特異性及高穩定性等特征［11］，circRNA特殊的結構特征使其具有特定的生物學功能。研究發現，circRNA參與了基因轉錄及轉錄后調控，通過不同的作用方式在細胞生命活動中發揮重要功能［7］。

2.1 miRNA sponge

circRNA富含miRNA結合位點，通過堿基互補配對吸附miRNA，阻止miRNA在3'非翻譯區與mRNA相互作用，進而間接調控miRNA下游靶基因的表達，發揮競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的功能［12］。由于circRNA的長度和序列不同，其結合的miRNA分子數量與種類也各不相同。

目前已發現7種circRNA具有miRNA“海綿”作用。CDR1as是在哺乳動物(主要是人和小鼠)腦中高度保守、高豐度的ecircRNA［5，6］，含有70多個miR-7的結合位點，通過吸附miR-7a調控其靶基因PARPA和SP1的mRNA表達水平［13］，因此，CDR1as被稱為miR-7的circRNA“海綿”。Sry轉錄而來的circRNA包含16個miR-138的結合位點，可通過吸附miR-138抑制其活性，從而調控多種生理病理過程［14］。circITCH可與miR-7、miR-17和miR-214結合，導致ITCH表達上調，進而抑制WNT信號通路［15］。通過功能恢復實驗發現circHIPK3能直接與miR-124結合，沉默circHIPK3抑制細胞生長［16］。

2.2 調控蛋白結合

circRNA可與mRNA調節的結合蛋白(RNAbinding protein，RBP)結合形成RNA-蛋白質復合體(RNA-protein complex，RPC)，進而改變剪接模式或mRNA穩定性。Du等［17］研究顯示，circFOXO3可與抗衰老蛋白ID1、轉錄因子E2F1及低氧誘導因子1亞單位α(hypoxia inducible factor 1 subunit α，HIF1-α)相作用，阻止RBP蛋白的核定位，導致心臟衰老。盲肌(muscleblind，MBL)與其親本基因第2外顯子相結合，可促進其環化生成circMbl，Ashwal-Fluss等［18］研究發現，MBL與circMbl相互作用，可調控circMbl和動脈粥樣硬化性心血管疾病相關因子circANRIL與必需的PES1相結合，抑制血管平滑肌細胞和巨噬細胞中核糖體的生物合成，進而導致核仁應激和細胞死亡［19］。

2.3 調控基因轉錄

研究表明，circRNA能夠調控其親本基因的表達。ciRNA可與RNA聚合酶Ⅱ相互作用調節基因的轉錄，目前已知的ciRNA有ci-ankdr52、cimcm5和ci-sirt7等。EIcircRNA與小核糖核U1 snRNP相互作用形成復合體，該復合體可在其親本基因啟動子區與RNA聚合酶Ⅱ結合，調控其親本基因的表達［7］。研究發現，利用RNAi技術敲低circEIF3J和circPAIP2的表達，可降低EIF3J和PAIP2的轉錄［7］。而其它circRNAs能否以類似的方式參與基因的調控還有待進一步探索。Conn等［20］研究發現，circSEP3可與SEP3基因座結合形成R-loop(RNA與RNA雜交環)，減弱線性SEP3與DNA的結合，從而導致circSEP3過度表達產生的擬南芥花與正常植物表型存在差異。

2.4 編碼翻譯功能

circRNAs因缺少5'端帽子和3'端poly(A)尾巴不能進行帽依賴性的蛋白質翻譯，故早期被認為無法翻譯編碼蛋白。隨后科學家們逐漸發現circRNA可通過特殊的方式進行蛋白質翻譯，部分circRNA可通過作為內部核糖體進入位點(IRESs)的序列，促進起始因子或核糖體直接與可翻譯circRNAs的結合;circRNA在缺乏IRES、poly(A)和5'帽結構的條件下，可通過RCA機制翻譯蛋白質;在IRES人工引入circRNA分子后，其可在293T細胞中進行蛋白質翻譯;circRNA含有多個m6A甲基化修飾位點，在單個m6A的驅動下circRNA可翻譯合成蛋白質。

3 circRNA在骨骼肌中的相關研究

目前，有關circRNA的研究主要集中在醫學方面，如癌癥發生、心血管疾病等生理病理過程，而在肌肉生長發育方面的研究鮮有報道，尤其是與動物骨骼肌生長發育相關的circRNA。研究表明，動物肌肉生長發育除了受骨骼肌轉錄調節因子Myf4、Myf5、Myf6、肌細胞生成素(Myogenin)，肌細胞增強因子家族(Myocyte enhancer，MEF)等主效基因的調控，也受circRNA、lncRNA等非編碼RNA的調控［21-23］。肌細胞增殖分化是影響肌肉發育重要的因素，因此研究者推測circRNA在肌肉生長發育過程中具有重要功能。

3.1 豬

許多學者就circRNA在骨骼肌中的調控作用在家養動物中開展了相關研究。Liang等［23］對貴州小型豬的9個器官和3個不同發育階段的骨骼肌進行circRNA全基因組分析，發現149個circRNAs與肌肉發育相關，并構建了首個豬的circRNAs數據庫。而且circRNA對骨骼肌的調控機制具有時序性，在豬出生0～30d時，circRNA主要對骨骼肌的生長發育和肌纖維類型轉換進行調控，而在30～240d時，其主要調控骨骼肌糖代謝和鈣離子信號。Sun等［24］對長白豬和藍塘豬的背最長肌進行轉錄組測序，篩選出236個差異表達的circRNAs，其中40個circRNA參與到26種miRNA介導的ceRNA相互作用的海綿調節劑，并提出circRNA可能對豬骨骼肌發育有潛在的轉錄后調控作用。Liu等［25］對大白豬肌肉轉錄組分析發現，肌肉中差異表達基因主要富集在TGF-β、MAPK等信號通路中，而TGF-β可通過促進纖維細胞增殖調控肌肉發育，使大白豬出生后肌肉肥大。Voillet等［26］對不同胚胎期的大白豬骨骼肌發育機制進行多組學關聯分析，結果表明，轉錄物和蛋白質的功能主要集中在骨骼肌發生后期至肌肉成熟階段的物質能量代謝過程中。目前，對豬骨骼肌中circRNA的研究主要以篩選和鑒定為主，在肌肉發育中的功能及調控機制方面的研究尚少，可能是因為功能調控方面的研究涉及到細胞層面，需要對豬胚胎、幼年和成年時期進行屠宰。因此，circRNA與豬骨骼肌生長發育的關聯還有待進一步研究。

3.2 牛

魏雪峰等［27］研究了秦川牛骨骼肌兩個發育階段(胚胎和成年肌肉長肌)的circRNA表達譜，鑒定出1個在牛肌肉中特異性表達的circLMO7，發現circLMO7可競爭性結合miR-378a-3p，解除對靶基因HDAC4的抑制作用，從而調控肌細胞的增殖分化。Li等［28，29］研究發現，circFUT10、circFGFR4分別通過吸附miR-133a和miR-107調控秦川牛骨骼肌細胞的增殖分化過程。上述研究表明，circRNA在秦川牛骨骼肌發育過程中具有重要調控作用。然而，尚未有circRNA在牦牛骨骼肌發育過程中的相關研究，主要是涉及到牦牛批量屠宰，且牦牛多為高原地區牧民散養，批量購買經費較多。今后可在秦川牛的研究基礎上，開展circRNA與牦牛肌肉生長發育的關聯性研究，通過研究其肌肉發育相關circRNA提高牦牛產肉率及肉品質特性，為牦牛分子育種提供理論依據，同時可從非編碼RNA的角度探索牦牛與其他牛種的遺傳特性。

3.3 綿羊

石田培等［30］研究顯示，綿羊大多數差異表達circRNA主要富集MAPK信號通路中，MAPK信號通路是參與調控肌細胞增殖分化的關鍵通路，直接或間接地參與綿羊胚胎肌肉的發育調控。在比較組中還發現circRNA2324只在D85和D105兩個階段上調，在D135時顯著下調，說明在胚胎骨骼肌發育后期，circRNA2324的作用受到抑制。Li等［31］使用RNA-Seq分析了胚胎、成年時期哈薩克綿羊肌肉中circRNAs的表達情況，發現多個circRNAs含有與肌肉生長發育相關miRNAs的多個吸附位點，如oar_circ_0001413同時包含miR-133、miR-125、miR-107等多個miRNAs結合位點。circHIPK3可通過結合到9個miRNAs的18號結合位點調控細胞生長，因此推測綿羊肌肉的生長發育可能受到circRNA的內源性調控。

3.4 人、猴和雞等其他物種

Kotb等［32］研究發現，circRNA在猴子的骨骼肌發育中存在大量年齡依賴性的表達，直接或間接的調控肌原性轉錄因子和肌原性視黃醇結合蛋白。Ouyang等［33］對雞3個發育時期腿肌的circRNAs進行轉錄組測序，在946個外顯子circRNAs中發現有150個已知的miRNA的結合位點，circRBFOX2可競爭性結合miR-206抑制成肌細胞的增殖分化。

circRNA調控人體骨骼肌生長發育及相關疾病的發生方面也開展了大量研究。Legeini等［34］研究發現，circ-ZNF609直接翻譯出來的蛋白可以調控肌肉的生長發育。Qian等［35］研究發現，circ19142、circ5846通過調節骨形態發生蛋白2(BMP2)促進成骨細胞的分化，且這兩種circRNA正向調控成骨細胞的發育過程。李瑞［36］在C2C12成肌細胞中發現，肺腺癌轉移相關轉錄因子Malat1可通過結合miR-133位點調控其靶基因SRF的表達，從而影響成肌細胞的分化。Liu等［37］的研究表明，circRNA-CER可作為ceRNA調節MMP13的表達從而調控軟骨細胞胞外基質的降解過程，推測circRNACER可作為骨關節炎潛在的治療靶點。上述研究表明，circRNA在人骨骼肌的生長發育過程中也發揮重要作用，推測circRNA可能成為一種疾病診斷、預測方面的生物標志，尤其在癌癥的發現和預防方面具有重要作用。以上研究顯示，對豬、猴骨骼肌中circRNA的研究以篩選和鑒定為主，牛、綿羊、雞和人中circRNA的研究主要涉及到其miRNA“海綿”作用，對circRNA調控各物種骨骼肌生長發育的機制研究還不夠深入，很多動物肌肉生長發育的相關因子有待進一步鑒定，其功能還待進一步闡明，因此需加強對動物骨骼肌生長發育相關circRNA的鑒定、功能及調控機制等方面的研究，為進一步從功能調控方面探索與動物肌肉發育相關的circRNA，檢測其對下游靶基因表達的影響和改善動物遺傳素材提供基礎數據。

4 小結

circRNA特殊的閉合環狀結構預示著它具有潛在的新功能，在未來可能成為一種新型的生物學標志。隨著高通量測序技術和生物信息學的快速發展，越來越多的circRNA被發現，但目前circRNA的研究仍處于起步階段，主要以篩選和鑒定為主，有很多問題亟待解決，如circRNA數據庫尚未建立完全，僅建立了人、豬、小鼠的circRNA數據庫;circRNA的生物學功能也尚存一定爭議;在高通量測序時需要減少檢測帶來的假陽性;circRNA的研究已涉及多個領域，如基因轉錄、信號轉導、細胞增殖分化等，但其分子形成機制、生物學功能及在肌肉生長發育中的調控機制仍需進一步研究探索，尤其是與動物骨骼肌生長發育相關的circRNA。可能是因為circRNA是一種新型環狀分子，研究較少，缺少相關研究的參考文獻;部分物種生長周期長，不便于采集樣品;進行circRNA的鑒定和功能分析，需要屠宰一定量的動物以采集試驗樣品，采買經費較高。目前已有研究表明，circRNA在動物骨骼肌生長發育過程中具有重要調控作用，這或將成為動物遺傳育種工作的新思路。因此，進一步挖掘新的circRNA，鑒定其種類及表達模式，探索circRNA調控網絡，闡明其對動物肌肉生長發育的作用機制，為深入研究動物肌肉生長發育提供新的基礎數據。隨著信息技術和研究工具的不斷發展，相信在不久的將來，circRNA在調控動物肌肉生長發育方面的研究將有突破性進展。