動物遺傳育種技術發展歷程

薛星星，許發芳，王磊，韓啟春，楊迎春，張智德，莫華山，周桂花，張陸德，吳國芳

(1.青海大學畜牧獸醫科學院 青海省高原家畜遺傳資源保護與創新利用重點實驗室，西寧810016;2.青海省互助八眉豬原種育繁場，海東810599;3.八眉豬養殖技術服務中心，海東810599)

中國是世界上畜禽遺傳資源最豐富的國家之一，目前主要有豬、雞、牛、羊等20個物種，共576個品種，其中地方品種約426個［1］。種業是畜牧業可持續發展的車頭，動物遺傳育種技術的變革是種業發展的加速劑。伴隨著現代育種技術，如基因編輯技術的變革，基因組學、轉錄組學、代謝組學等新興學科的飛速發展，家畜動物育種已經從傳統的育種方法向快速改善動物基因型的分子水平方向發展，現代育種速率與傳統育種相比提高了3倍之多，為我國自主動物種業的發展，突破國際種業壁壘，保障我國畜牧業迅猛奮戰保駕護航。

1 動物常規育種

動物傳統育種方法是以遺傳學基本理論為基礎的育種措施。通過表型值推斷基因型或計算育種值，進而對性能做出總體評估，作為留種依據決定種畜的選擇與淘汰。它將數量遺傳學原理應用于育種實踐，通過采用雜交改良、品系選育等技術，實現動物品種不斷改良和雜種優勢利用。常規育種包括性能測定、系譜測定、同胞測定、后裔測定。性能測定適用于遺傳力高、能直接度量的性狀，如畜禽日增重、飼料報酬等。性能測定時可分一次記錄、多次記錄和部分記錄。同胞測定是根據同胞表型均值來對個體選留與淘汰，適用于遺傳力低、難以度量或不可能度量的性狀。豬、雞等多胎畜禽適宜用該方法進行選擇。后裔測定根據后裔綜合表現來評定，多用于公畜。系譜測定通過分析各代祖先的生產性能推斷其后代品質，多用于尚處于幼年或青年時期的種畜，單獨使用系譜測定，對改良畜群的作用較小，應與其他方法結合起來使用［2］。

2 數量遺傳學與動物育種

數量遺傳學從表型方差中剖分出基因型方差，通過運用資料設計和統計模型估計有關的遺傳參數，最終達到選種目的，是遺傳學的重要分支。主要應用于估計遺傳參數、通徑分析和畜禽育種估計模型方法。1909年瑞典遺傳學家尼克松—埃勒提出了多基因學說，上世紀二十年代，美國遺傳學家賴特、英國統計學家和遺傳學家費希爾、生理學家和遺傳學家霍爾丹為數量遺傳學奠定了理論基礎。二十世紀五十年代以來，隨著線性代數、概率論、多變量分析和隨機過程等學科的進一步發展和應用，數量遺傳學的內容有了進一步的豐富［3］。二十世紀六十年代，Henderson提出運用最佳線性無偏估計(Best linear unbiased prediction，BLUP)對動物個體進行育種值估計，BLUP技術作為畜禽遺傳評定重要方法［4］，其主要應用于種公畜的評定，以及對遺傳趨勢和配合力的估計。BLUP法的基本原理是線性統計模型方法論與數量遺傳學相結合，該方法既能估計模型固定效應，又能預測隨機的遺傳效應，起到提高育種值估計準確性，加速畜禽重要經濟性狀遺傳改良進程的作用。

3 動物分子育種技術

分子遺傳標記的基礎是個體間核苷酸序列的變異，它能夠對個體DNA水平的遺傳多態性進行直接反映。理想的分子標記應具備以下優點:高多態性、共顯性遺傳、遍布整個基因組且分布均勻［5］。目前，主要的分子遺傳標記包括:數量性狀基因座(Quantitative trait locus，QTL)、基于DNA的分子標記RFLP(Restriction fragment length polymorphism)、基于PCR的分子標記RAPD(Random amplified polymorphic DNA)和SSR(Eimple sequence repeats)、基于PCR與限制性酶切技術相結合的AFLP(Amplified fragment length polymorphism)以及基于單核苷酸多態性的SNP(Single nucleotide polymorphism)。RFLP作為第一代分子標記技術，能夠直接在DNA水平上測定遺傳變異［6］。

標記輔助選擇對表型、系譜和遺傳標記的信息進行了充分運用，而常規育種方法只利用了表型和系譜信息，所以標記輔助選擇具備更大的信息量［7］。遺傳標記在動物選育中的運用可顯著加快動物育種的遺傳進展。在畜禽生產中，很多重要的經濟性狀都是數量性狀，而QTL是控制數量性狀的基因在畜禽個體基因組中的位置。對遺傳標記的選擇通過MAS(Marker assisted selection)來實現，可以確定出影響該性狀的基因效應值的大小及在染色體上的位置，從而更好的實現對該性狀的調控［8］。

MAS在畜禽上的應用十分廣泛，STIM1(Stromal interaction molecules 1)基因是影響繁殖性狀的基因，孫華等［9］在法系大白豬上的研究表明，STIM1的NN基因型為優勢基因型，能夠提高母豬產仔數和產活仔數。視黃醇結合蛋白4(Retinol-binding protein 4，RBP4)對豬的產仔數有促進作用，是豬繁殖性能的候選基因［10］。翟騰蛟等［11］研究表明，RBP4的AA基因型大白豬產仔數、產活仔數及健仔數多。耿社民等［12］研究表明，前白蛋白-3(Prealbumin 3，PA-3)2-2型為絨山羊產絨量和體重兩個經濟性狀的優勢標記基因型。李志才等［13］在湘西黃牛上的研究發現，心型脂肪酸結合蛋白(Heart type-fatty acid binding protein，H-FABP)的AA基因型為優勢基因型，與肌內脂肪含量和大理石花紋呈正相關。

4 基因組編輯技術

基因組編輯技術是一種新興的利用限制性內切酶在特定DNA位點切割，誘導細胞產生非同源末端連接或同源重組修復機制，并對損傷DNA進行修復，從而實現對基因組定點修飾的技術，其可對目標基因實現定點突變、片段的敲除或敲入等［14］。代表性的有鋅指蛋白核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFN)技術［15，16］、轉錄激活樣效應因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術［17］、成簇規律的間隔短回文重復相關蛋白9核酸酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR/CRISPR-associated protein 9，Cas9)技術。傳統的基因修飾技術是通過胚胎干細胞的同源重組實現基因組的靶向修飾［18，19］，只能切割短且簡單的基因序列，與之相比基因組編輯技術打靶效率高、應用范圍廣、構建成本低［20，21］。

4.1 鋅指核酸酶技術(ZFN)

鋅指核酸酶是一種人工改造的核酸內切酶，由特異性識別DNA的鋅指蛋白和非特異性核酸內切酶FokⅠ構成切割域兩部分組成［22，23］。FokⅠ是來源于海床黃桿菌(Flavobacterium okeanokoites)的一種限制性內切核酸酶［24］，切割結構域需要形成二聚體才能發揮活性，所以必須由一對ZFN結合在4～6個間隔的DNA雙鏈上的靶序列上形成二聚體切割DNA［25，26］。常用的鋅指(Zinc finger，ZF)由3～4個鋅指蛋白組成，每個鋅指能夠識別連續的3個堿基，因此兩個ZFN共可以識別18個或者24個堿基，可高度特異地識別基因組中的基因序列［25］。ZFN技術被應用于不同的物種，在細胞水平及整體水平上實現基因的定向修飾。Fatemeh Salabi［27］運用ZFN技術對綿羊肌衛星細胞上的肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)基因進行敲除，結果提高了細胞周期蛋白依賴激酶2(Cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和卵泡抑素(Follistatin，FST)的表達，而降低了p21(CDKI)(Cyclin-dependent kinas inhibitor)基因的表達，同時還發現MSTN基因敲除能顯著增加細胞的增殖能力。趙宇航等［28］獲得了MSTN(Myostatin)雙等位基因突變的牛成纖維細胞株，將外源基因高效整合到牛MSTN基因位點，推動轉基因技術的發展。崔文濤等［29］也利用ZFN技術在梅山豬胎兒成纖維細胞上敲除了MSTN基因，并結合體細胞核移植和胚胎移植技術，成功獲得了國際首例MSTN基因編輯克隆梅山豬。雖然ZFN靶向結合效率高，但是它的設計對專業知識要求高，費時費力，同時它還會發生脫靶效應，產生錯誤酶切，目前的技術還無法讓它實現對任意靶基因的切割［30］。

4.2 類轉錄激活因子核酸酶(TALEN)技術

轉錄激活子樣效應因子(Transcription activatorlike effector，TALE)最初發現于黃單胞桿菌屬。與ZFN技術類似，TALEN是由TALE蛋白的DNA結合域和Fok I核酸內切酶切割域組合而成。TALE蛋白由核定位信號、DNA特異性識別結合結構域和靶位點基因轉錄催化等部分組成［29，31-33］。其中的DNA特異性識別結合結構域由兩部分組成，一部分是由1到33個長度為33～35個氨基酸殘基的重復單位串聯后形成，另一部分由一個含有20個氨基酸殘基的半重復單位構成，兩者共同組成此結合結構域［34］，其中第12和13位的氨基酸為重復序列可變的雙氨基酸殘基(Repeat variable diresidues，RVD)［35，36］，決 定 了TALENs的 識 別 功 能［37］。TALEN技術與ZFN相比，簡化了篩選過程，通過簡單的分子克隆就可以構建出高效的TALEN，并且與DNA序列結合更嚴格，對受體細胞的毒性低。TALEN技術目前主要應用在基因敲除方面，是否適合大片段基因的插入尚不明確。

TALEN與顯微注射等技術相結合，被廣泛應用到動植物育種等多個領域。宋紹征等［38］運用TALEN技術敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白(Beta-lactoglobulin，BLG)基因，同時在BLG基因座定點整合人乳鐵蛋白(Human lactoferrin，hLF)基因，在去除乳中過敏原的同時還增加了營養成分。唐成程等［39］利用TALEN技術在家兔CCR5(CC chemokine receptor 5)基因位點中定點敲入人的CD4(Cluster of differentiation 4)和CCR5基因，為建立艾滋病研究新動物模型奠定基礎。吳彩霞等［40］對豬基因組內源性基因Tiki1(TraB domain containing protein 2A)進行定點修飾，成功且高效率地構建了豬內源性基因Tiki1敲除的大動物模型。張歡歡等［41］構建TXNIP(Thioredoxin interaction protein)基因TALENs載體，將mRNA通過顯微注射到小鼠受精卵中，獲得移碼突變成功制備TXNIP基因敲除鼠。吳子環等［42］在小鼠Fndc5(Fibronectin type III domain-containing protein5)基因中進行了TALEN質粒對的構建，將其質粒對轉錄為mRNA后注射到小鼠受精卵中，共出生23只小鼠，再對出生兩周的小鼠進行基因型分析和鑒定。最終獲得了4種不同的Fndc5基因敲除小鼠品系，為進一步探究該基因在動物體內的功能作用提供了動物模型。

4.3 CRISPR/Cas系統

CRISPR/Cas技術作為第3代基因編輯技術，全稱為成簇的、規律間隔的短回文重復序列。二十世紀八十年代，Ishino等［43］在大腸桿菌中發現了成簇的規律間隔的短回文重復序列。直到2002年，Jansen等［44］才 將 這 種 重 復 序 列 命 名 為CRISPR。CRISPR/Cas系統作為一種廣泛存在于細菌和古細菌中的免疫保護機制，可以介導外源DNA的降解，進而抵御外來入侵［45，46］。目前，研究最多的是CRISPR/Cas9，它由Cas9蛋白與sgRNA(Singleguide RNA)構成，通過sgRNA與靶序列DNA的堿基配對，利用Cas9蛋白精準切斷DNA雙鏈，從而產生雙鏈損傷，進而進行特異位點的基因編輯［47］。CRISPR/Cas9技術的效率非常高，大大縮短了轉基因動物的制備時間。

目前，CRISPR/Cas9技術在提高家畜經濟性狀方面大放異彩。梁紅宇等［48］利用CRISPR/Cas9技術對毛囊發育相關基因VEGF(Vascular endothelial growth factor)在CCR5位點定向敲入并獲得陽性單細胞克隆，通過體細胞核移植技術和原核注射法制備VEGF基因定點整合絨山羊，為今后培育產絨量高的絨山羊新品種奠定了基礎。梅珺琰［49］、Wang［50］、李光鵬等［51］利用CRISPR/Cas9技術，分別培育出MSTN基因突變山羊、豬和黃牛，大大提高了動物的產肉性能。Xiaolong W［46］、Li W R等［52］利用CRISPR/Cas9技術對在毛發生長環節中起負調節作用的FGF5(Fibroblast growth factor 5)基因進行敲除，提高了絨山羊、中國美利奴綿羊羊毛的產量和品質。Han X等［53］利用CRISPR/Cas9技術在酪蛋白α-s1 3’端特異性敲入乳鐵蛋白基因，使轉基因豬初乳及乳汁中乳鐵蛋白可以持續高表達。Ma T等［54］利用CRISPR/Cas9技術成功構建了AANAT(Arylalkylamine N-acetyltransferase)和ASMT(Nacetyl-5-hydroxytryptaminemethyltransferase)轉基因綿羊，利用乳腺反應器提高乳汁中褪黑激素的產量。

CRISPR/Cas技術要想實現對特定位點的突變，需要對gRNA進行設計和合成。由于PAM序列存在概率高，所以編輯位點的可選擇性很高，最大的優勢是其不僅能夠對單個位點進行編輯，還能同時對多個位點進行編輯。雖然CRISPR/Cas優點突出，但也存在一些缺點，比如，核酸內切酶越大，轉化難度也相對較大，脫靶效應嚴重，不同物種中編輯效率不同，就CRISPR/Cas9系統而言，僅需靠近PAM序列的12個堿基配對即可，對于遠端的8個堿基并不需要嚴格配對，所以存在容錯性，還需要進一步改進［55］。

5 GWAS在動物育種中的應用

近十幾年來，基因組技術迅速發展趨于成熟，使得全基因組關聯分析(Genome-wide associationstudy，GWAS)已成為經濟性狀候選基因的分析方法［56］，借助全基因組范圍的分子標記進行總體關聯分析，然后通過基因分型比較復雜性狀和對照組之間基因頻率差異，進而統計它們與性狀之間的關聯性大小，選出最顯著相關的遺傳變異，最后采用驗證的方法確立變異與目標性狀之間的相關性［57-59］。GWAS也越來越多地應用于家畜重要性狀的研究領域，在動物遺傳育種中，通過對家畜基因組進行GWAS分析研究，找到控制家畜主要經濟性狀的重要SNPs，從而挖掘重要經濟性狀的候選基因。

5.1 豬

阮鵬等［60］利用GWAS技術對嵊縣花豬、金華豬繁殖性能相關SNP位點進行分析，發現嵊縣花豬的候選基因有6個，分別是SEMA4D(Semaphorin4D)、EYA4(Eye absent 4)、ZC3H12D(Znc finger CCCH domain-containing protein12d)、BANP(BTG3 associated nuclear protein)、DIP2B(Disco-interacting protein 2 homolog B)以及TUSC3(Tumor suppressor candidate 3);金華豬的候選基因有3個:SPINK14(Seeine protease inhitor Kazal type 14)、GRIP1(Glucocorticoid receptor-interacting protein1)和PPP3CA(Protein phosphatase 3 catalytic A)。趙杰［61］運用GWAS技術對正常豬、鎖肛豬和基因攜帶豬進行分析，篩選出3個與肛門閉鎖有關的候選基因:PTPRB(Protein tyrosine phosphatase，receptor type B)、BMP6(Bone morphogenetic protein 6)和ANKRD6(Ankyrin repeat domain protein 6)，為豬肛門閉鎖的遺傳機制研究提供了一些思路。趙海燕等［62］通過GWAS技術在深縣豬16號染色體上篩選出了4個與6月齡體重相關的候選基因:MTMR12(Myotubularin related protein 12)、NPR3(Natriuretic peptide receptor 3)、PDZD2(PDZ-domain containing-2)和TARS(Tyramine receptors)。謝健［63］發現與香豬產仔數性狀顯著關聯的SNP位點25個(DIAS0001380、ALGA0004742等)，潛在關聯SNP位點7個(ASGA0020493、ALGA0012897等)，同時還篩選到了可能與香豬產仔數性狀有關的候選基因ZEB1(Zinc finger E-box binding homeobox 1)、PDIA4(Protein disulfide isomerase 4)、MARCKS(Myristoylated alanine-rich C kinase substrate)、HDAC2(Histone deacetylase 2)等。梁躍［64］采用混合線性模型對廣東長白豬的仔豬出生重和7個基因的SNP進行了關聯分析，發現其中4個基因:IGJ(Immunoglobulin J chain)和ABCF1(ATP-binding cassette subfamily F member 1)等的SNP基因型與仔豬出生重性狀間存在顯著差異。Wang等［65］利用GWAS技術對82頭母豬的仔豬初生重進行了研究，在全基因組中共發現266個SNP基因型(ALGA0007307、DRGA0004275等)與仔豬初生重存在顯著差異，它們大多集中分布在1、7、13、14、15和18號染色體上。Guo等［66］利用GWAS技術對仔豬數量和仔豬死亡率相關的QTL區域進行了分析，發現與窩產仔數和仔豬死亡率有關的QTL區域共15個，分布在1、2、3、6、7、9、13和14號染色體上。

5.2 牛

李俊［67］利用GWAS技術對可能影響水牛產奶性能和繁殖性能的候選基因進行篩選鑒定，最后鑒別到與繁殖性狀相關的SNP有40個(AX-85104022、AX-85147160、AX-85066093等)，相關候選基因28個:SESN3(Sestrin 3)、PRDM5(PRDIBF1 and RIZ domain-containing 5)、IQGAP3(IQ motif containing GTPase-activating protein 3)等，還獲得與泌乳性狀相關的10個SNP(AX-85111042、AX-85119569、AX-85061501等)、5個候選基因:PTPN11(Protein tyrosine phosphatase，non-receptor type 11)、COX18(Cytochrome c oxidase-assembly factor 18)和LRP2(Low density lipoprotein receptorrelated protein 2)等，同時還發現LRP2基因可作為水牛泌乳性能的候選基因。苗健［68］利用SWAG技術對可能影響西門塔爾牛骨重的性狀進行了研究，共篩選出10個顯著關聯基因:CHSY1(Chondroitin sulfate synthase)、LAP3(Leucine aminopeptidase 3)和LARP4(La-related protein 4)等。Schopen等［69］對上千頭荷斯坦奶牛進行基因分型，共篩選出50228個SNPs，進一步分析發現20號常染色體與乳蛋白的含量和組成有關聯，同時發現與乳蛋白組成或蛋白質百分比相關的主要基因組區域分布在5、6、11和14號染色體。Sodeland等［70］通過GWAS鑒定影響乳腺炎易感性的多態性，在對2589頭牛常染色體上的17349個SNPs的基因型進行分析后，在2、6以及20號染色體上發現了影響乳腺炎發生的QTL。

5.3 羊

He等［71］利用GWAS對阿勒泰羊、蒙古羊和泗水裘皮羊進行了分析，結果在2號染色體132.6～132.7 Mb區間發現了與綿羊多角性狀相關的基因區段，此研究為羊角性狀的選育提供了理論基礎。狄江等［72］對365只新疆型中國美利奴羊進行了GWAS分析，結果發現3種基因:FIBIN(Fin bud initiation factor homolog)、HSD17B11(Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 11)和PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)參與了羊毛的生長發育過程。Demars等［73］用GWAS技術對法國Grivette羊和波蘭Olkuska羊分析后發現BMP15(Bone morphogenetic protein 15)基因與控制產羔數呈密切關聯。

6 總結

隨著現代生物技術的迅速發展，動物遺傳繁育技術研究的不斷深入和產業化發展的需要，動物育種從以數量性狀為主的傳統育種方法向著快速改變基因型方向分子育種發展。BLUP、分子標記輔助選擇、基因編輯、全基因組選擇等技術，很大程度提高了動物育種速度和繁殖效率，使得動物育種工作形成一套完整、新興、可持續、高效的產業體系。