復方黃芪乳膏高效液相色譜指紋圖譜的建立及3種成分的測定

劉玉娟，王永潔，郭子右，李婷婷，郝逗逗，梅凱，李鑫，吳清（北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488）

復方黃芪方是針對癌性腹水患者進食差、疼痛而開發的中藥外敷方。方中含有黃芪、鹽車前子、桂枝等藥材，共奏益氣溫陽、化瘀利水之效，其療效也在前期的臨床觀察和相關藥理研究中得到驗證[1-3]。本課題組結合現代中藥制劑研究技術以及各劑型的特點，將本方制成使用方便、性質穩定且藥物釋放、穿透較快的O/W型乳膏劑，尤其適用于不能口服藥物的患者，能有效地減輕患者腹部脹滿等不適癥狀，提高患者的生活質量。

為保證復方黃芪乳膏制劑的質量，需借鑒質量控制新思路對其進行研究[4-7]。近年來，中藥指紋圖譜的研究多見報道，可評價中藥制劑質量的真實性、優良性和穩定性[8-9]。本研究按照中藥指紋圖譜研究的技術要求，建立了該制劑HPLC指紋圖譜，并同時測定了其中京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸的含量，以期為復方黃芪乳膏的質量標準建立提供參考[10-16]。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀（Thermo，USA）；Mettler AE 240 型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復方黃芪乳膏（批號：20191209，20191210，20191211，20191212，20191213，20191216，20191217，20191218，20191219，20191220，自制）；黃芪（批號：81320901）、紅花（批號：73390801）、桂枝（批號：84120901）、大腹皮（批號：81520501）、鹽車前子（批號：81440801）、炒牽牛子（批號：80340101）（北京三和藥業有限公司）。甲醇、乙腈（色譜級，賽默飛世爾科技公司）；甲酸、磷酸（天津市光復科技發展有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

羥基紅花黃色素 A（批號：5VRT-PYDB，含量：91.9%）、咖啡酸（批號：X221-42M3，供含量測定用）、毛蕊花糖苷（批號：111530-201713，含量：92.5%）（中國食品藥品檢定研究院）；京尼平苷酸（批號：Y02A9H57757，含量：98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：KO1014CB14，含量：98%）、肉桂酸（批號：AA0807DA14，含量：98%）（上海源葉生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～15%A；15～45 min，15%～30%A；45～50 min，30%～35%A；50～80 min，35%～50%A；80～100 min，50%～70%A；100～110 min，70%～90%A）；體積流量0.8 mL·min－1；柱溫30℃；檢測波長250 nm；進樣量10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取各對照品適量，置于量瓶中，75%甲醇定容至刻度，作為儲備液，精密吸取適量，加75%甲醇配制成每1 mL分別含京尼平苷酸、羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、咖啡酸、肉桂酸150、90、120、320、260、75 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取各批次復方黃芪乳膏1 g，精密稱定于錐形瓶中，加入25 mL75%甲醇，超聲處理30 min，放冷后補重，搖勻濾過，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 單味藥供試品溶液的制備

按處方工藝制得黃芪、紅花、鹽車前子、大腹皮、炒牽牛子、桂枝單味藥提取液，精密吸取各1 mL于5 mL量瓶中，加75%甲醇定容，搖勻，過 0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.5 指紋圖譜方法學考察

2.5.1 精密度考察 取“2.3”項下供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次。以京尼平苷酸為參照峰，結果各共有峰相對保留時間RSD＜0.53%，相對峰面積RSD＜1.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性考察 取“2.3”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進行測定。以京尼平苷酸為參照峰，結果各共有峰相對保留時間RSD＜0.69%，相對峰面積RSD＜1.3%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.3 重復性考察 取同一批復方黃芪乳膏按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以京尼平苷酸為參照峰，結果各共有峰相對保留時間RSD＜0.83%，相對峰面積RSD＜2.7%，表明方法重復性良好。

2.6 HPLC指紋圖譜的建立、相似度評價及共有峰相關分析

2.6.1 指紋圖譜的構建 取10批復方黃芪乳膏，按“2.3”項下方法制備供試品溶液并進行分析，得到HPLC色譜圖，導入《中藥指紋圖譜相似度評價系統》（2012 A版）進行色譜峰匹配，生成疊加圖及對照指紋圖譜，見圖1。以1號峰作為參照峰（S），計算相對保留時間。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.48%（見表1），說明出峰時間均較穩定，相對峰面積RSD值均小于7.5%（見表2），表明不同批次的復方黃芪 乳膏質量差異較小。

表1 10批復方黃芪乳膏指紋圖譜共有峰相對保留時間 Tab 1 Relative retention time of common peaks in fingerprints of 10 batches of Compound Huangqi cream

表2 10批復方黃芪乳膏指紋圖譜共有峰相對峰面積 Tab 2 Relative peak area of the common peaks of the fingerprints of 10 batches of Compound Huangqi cream

圖1 10批復方黃芪乳膏指紋圖譜（S1～S10）及其對照指紋圖譜（R）Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 bathes of Compound Huangqi cream（S1～S10）and common mode of HPLC fingerprints（R）

2.6.2 共有峰的歸屬與指認 分別取單味藥供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，結果如圖2所示。經對照品保留時間定位及色譜峰分析，指認出 6個特征峰，1號峰為京平尼苷酸、6號峰為咖啡酸、8號峰為羥基紅花黃色素A、9號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、10號峰為毛蕊花糖苷及17號峰為肉桂酸。其中，1、10、13 號峰來源于鹽車前子，2、4、5、6、11、12、14 號峰來源于炒牽牛子，9、15、18號峰來源于黃芪，7、8、16、18號峰來源于紅花，17號峰來源于桂枝，3號峰來源于大腹皮。

圖2 復方黃芪乳膏共有峰歸屬Fig 2 Common peaks of Compound Huangqi cream

2.6.3 復方黃芪乳膏指紋圖譜相似度評價 將10批復方黃芪乳膏指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A版），生成對照指紋圖譜并計算相似度，見表3。10批復方黃芪乳膏樣品相似度均在0.93～1.00，說明復方黃芪乳膏批次間一致性良好。

表3 復方黃芪乳膏指紋圖譜相似度結果 Tab 3 Fingerprint similarity of Compound Huangqi cream

2.7 化學模式識別研究

2.7.1 聚類分析（CA） 采用SAS 8.2軟件，以10批復方黃芪乳膏指紋圖譜中18個共有峰的相對峰面積為變量，對樣品進行系統聚類，見圖3。當距離大于6時，10批樣品聚為2類，S1、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10為第1類；S2、S3為第2類，說明10批樣品只存在細微差異，化學指標成分總體穩定均一，與相似度分析結果相符（10批復方黃芪乳膏樣品相似度均在0.93～1.00，S2、S3樣品與其他批次樣品的相似度較低）。

圖3 10批復方黃芪乳膏樣品聚類分析結果Fig 3 Cluster analysis of 10 batches of Compound Huangqi cream sample

2.7.2 主成分分析（PCA） 為進一步比較不同批次樣品間的質量差異，將10批復方黃芪乳膏中18個共有峰面積導入到SPSS v26.0軟件中進行PCA，得出相關矩陣的特征值及其方差，見表4，碎石圖見圖4。由表4可知，因子1、2、3的特征值分別為11.548、3.808、1.579，累積貢獻率是94.084%。同時觀察碎石圖可見特征值曲線在成分3后存在一個明顯的拐點，說明前3個主成分的分析結果基本顯示出了不同批次復方黃芪乳膏之間的相似度和差異性。因子載荷矩陣見表5，第1主成分主要反映了來自色譜峰1、2、4、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17的 信 息，第2主成分主要反映了來自色譜峰3、5、12、14的信息，第3主成分主要反映了18號色譜峰的信息，故僅用前3個主要成分就可表示原HPLC數據的主要信息。以第 1、2、3 主成分為變量，得到三維投影圖，見圖5。以X軸為例，1、8、9、17號峰距離原點較遠，權重值分別為0.928、0.901、0.858、0.995，表明在復方黃芪乳膏中的作用較大，歸屬于第1主成分，與上述結果分析

表5 旋轉后的因子載荷矩陣 Tab 5 Factor load matrix after rotation

圖4 10批復方黃芪乳膏樣品因子的碎石圖Fig 4 Scree plot of factors of 10 batches Compound Huangqi cream sample

圖5 10批復方黃芪乳膏樣品旋轉后的因子載荷圖Fig 5 Factor load diagram after rotation of 10 batches Compound Huangqi cream sample

表4 主成分特征值及方差 Tab 4 Principal component eigen values and variance

2.8 各成分含量測定

2.8.1 線性關系考察 精密量取“2.2”項下京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸對照品儲備液適量，用75%甲醇制成20%、50%、100%、200%、300%、400%、500%水平的混合對照品一致，可判定1（京尼平苷酸）、8（羥基紅花黃色素A）、9（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、17（肉桂酸）號峰對于研究復方黃芪乳膏批次間一致性具有重要意義。溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表6，可知各成分在各自線性范圍內與峰面積線性關系良好。

表6 各成分線性關系 Tab 6 Linearity of various constituents

2.8.2 精密度試驗 取“2.8.1”項下100%水平的混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面積RSD分別為0.58%、0.87%、0.24%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 穩定性試驗 取同一批乳膏（S1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，測得京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面積RSD分別為1.3%、1.4%、1.8%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8.4 重復性試驗 取同一批乳膏（S1），按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣測定，測得京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸含有量RSD分別為1.4%、2.3%、1.4%，表明該方法重復性良好。

2.8.5 加樣回收試驗 取已知含量的同一批次乳膏（S1）0.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入質量濃度為75.376、58.720、36.840 μg·mL－1的京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸對照品溶液25 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸平均加樣回收率分別為103.5%、98.6%、97.2%，RSD分別為1.7%、2.3%、1.9%，表明方法準確度良好。

2.8.6 樣品含量測定 取復方黃芪乳膏1 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表7。初步確定，京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸含量分別為1.59～1.84 mg·g－1、1.37～1.58 mg·g－1、0.791～0.943 mg·g－1。

表7 各成分含量測定結果(mg·g－1) Tab 7 Content of various constituents (mg·g－1)

3 討論

3.1 指標成分確定

復方黃芪方中以黃芪和車前子為君藥，桂枝為臣藥，發揮益氣溫陽利水之功效。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中的主要藥效成分，具有提高免疫力、抗癌等多方面的藥理作用，其含量與總黃酮的含量成正相關，可作為質量評價指標[17-19]。京尼平苷酸作為車前子的指標成分之一，其代謝途徑和時效與車前子的利尿作用相關[20-21]。桂枝所含化學成分主要為揮發油類，預試驗以桂皮醛為指標成分，但其出峰時間及峰面積不穩定，推測與乳膏中其他飲片的成分發生反應或影響洗脫，而肉桂酸含量相對較高且穩定，故選擇作為指標成分[22-23]。

3.2 供試品制備方式考察

前期預試驗發現，復方黃芪乳膏中含有大量油脂性基質會干擾基線及峰形，因此對不同提取方式（超聲法、回流法）、不同提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇）進行考察，以期減小油脂性基質對蒸散響應信號的影響，達到色譜峰信息量最大化、提取效率最高。最終確定75%甲醇超聲提取。隨后對超聲頻率和超聲時間進行了考察，在不影響試驗結果的條件下，兼顧節能環保的理念，選擇超聲頻率為40 kHz，時間為30 min。

3.3 色譜條件考察

對4種不同型號的色譜柱 Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo BDS Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent 5 XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）及 Wates XBrige C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）進行考察，發現4種色譜柱分離情況差別較大，最終選擇基線平穩、色譜峰較多且峰形、分離效果較好的 Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

本方藥味較多，化學成分復雜且含有酚羥基和羧基等基團。為了有效地分離各成分，以緩沖鹽溶液和有機相進行梯度洗脫。考察了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流動相對指紋圖譜的影響，結果表明以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相，所得指紋圖譜峰形、分離效果較好，因此選用該體系。

指紋圖譜的波長選擇時，采用PDA檢測器進行190～450 nm全波長掃描，每隔20 nm 提取1個波長進行對比，結果顯示在250 nm波長下色譜峰較多，響應值較高信息較完全，因此選用250 nm作為指紋圖譜檢測波長。