土地類芽胞桿菌(Paenibacillus terrae)NK3-4 EsxA結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育分析

于文清，閆鳳超，劉文志,*，鄭桂萍，肖俊杰

(1.上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)院，江西 上饒334001；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院,哈爾濱 150036； 3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319)

EsxAs(早期分泌抗原靶6，Early secreting antigenic target-6，ESAT6)是一類小分子分泌蛋白，一般含有100左右個(gè)氨基酸，具有保守的WXG氨基酸基序[1]，因此被稱為WXG超級(jí)家族成員。該蛋白呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，與EsxB(CFP-10)共同組成VII型分泌系統(tǒng)(T7SS)，EsxA最先在動(dòng)物病原菌結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中發(fā)現(xiàn)[2]，與其致病力密切相關(guān)[3-5]，后陸續(xù)在其它動(dòng)物病原菌中也發(fā)現(xiàn)了該類蛋白[6]。EsxA除了與動(dòng)物致病菌的致病性相關(guān)外[7-8]，還能夠誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫原活性[9-11]，也有研究發(fā)現(xiàn)，在單核球增多性李斯特菌中(Listeriamonocytogenes)，EsxA與宿主病原菌的致病性無關(guān)[12]。在非致病細(xì)菌中也存在EsxA編碼基因，如在天藍(lán)色鏈霉菌中，EsxA與EsxB形成同源二聚體，與宿主菌成孢相關(guān)[13]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，植物根際促生菌土地類芽胞桿菌(Paenibacillusterrae)NK3-4基因組中攜帶著EsxA編碼基因，但EsxA在類芽胞桿菌中發(fā)揮何種功能尚無相關(guān)報(bào)道，是否與類芽胞桿菌對(duì)植物的促生效應(yīng)相關(guān)也尚未可知。本文采用生物信息學(xué)技術(shù)分析了該EsxA的基本性質(zhì)、蛋白的3D結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為包括NK3-4菌株在內(nèi)的類芽胞桿菌EsxA基因外源分泌表達(dá)、活性保持條件及功能的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NK3-4菌株EsxA基本性質(zhì)分析

將NK3-4基因組中注釋為毒力因子(Virulence factor EsxA)的氨基酸序列提交ExPASy Proparam tool(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析其基本性質(zhì)，將氨基酸序列提交NCBI中的BLSTp進(jìn)行序列相似性比對(duì)，并檢索保守域。

1.2 NK3-4菌株EsxA3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將NK3-4 菌株EsxA氨基酸序列提交在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive/rgsxPX/models/)，通過同源建模預(yù)測(cè)其3D結(jié)構(gòu)[14]，大致步驟如下：

(1)模板搜索選擇及建模：將序列提交SWISS-MODEL后，會(huì)自動(dòng)匹配相似的模板，對(duì)于每個(gè)識(shí)別的模板，都列出了預(yù)測(cè)模板-目標(biāo)匹配質(zhì)量，選擇質(zhì)量最高的模板建模。將模板與目標(biāo)序列比對(duì)，模板與序列之間保守匹配的結(jié)構(gòu)被從模板復(fù)制建模，用片段庫插入或刪除，再重新建模，而后重建側(cè)鏈，最后利用最小作用力的幾何學(xué)特性構(gòu)建模型。

(2)建模質(zhì)量評(píng)估及配基建模：利用QMEAM評(píng)分功能進(jìn)行全局性和殘基模型質(zhì)量評(píng)估。配基建模時(shí)，只有滿足以下全部條件后才代表存在配基：(i)配體在模板庫中注釋為生物學(xué)相關(guān)；(ii)配體與模型聯(lián)結(jié)在一起；(iii)配體與模型之間不沖突；(iv)與配體結(jié)合的殘基在模板與目標(biāo)蛋白之間是特異保守的。

1.3 NK3-4菌株EsxA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用MEGA6軟件對(duì)NK3-4菌株EsxA及與其同源性較高的蛋白序列進(jìn)行聚類分析，這些蛋白的氨基酸序列從Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中獲得。對(duì)比序列類型選擇“Translated protein Sequenences”，統(tǒng)計(jì)方法采用鄰接法(Neighbor-joining)，模板采用最大似然法(Maximum Composite Likeliood method)。系統(tǒng)發(fā)生檢測(cè)采用自舉法(Bootstrap method)，成對(duì)比對(duì)參數(shù)(Pairwise Alignment)為缺口開啟罰分(Gap Opening Penalty)：10,且缺口延伸罰分(Gap Extenson Penalty)：0.1；多重比較參數(shù)(Multiple Alignment)為缺口開啟罰分：10，缺口延伸罰分:0.2；蛋白權(quán)值矩陣(Protein Weight Matrix)：Gonnet；特殊氨基酸罰分(Residue-specific Penalties)：ON，親水性罰分(Hydrophilic Penalties)：ON；缺口分離距離(Gap Separation Distance)：4；末端缺口分離(End Gap Separation)：OFF。

2 結(jié)果與分析

2.1 NK3-4菌株EsxA的基本性質(zhì)

2.1.1 NK3-4 菌株EsxA的理化性質(zhì)

NK3-4菌株EsxA含有91個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量10 276.53 道爾頓，理論等電點(diǎn) 5.29，分子式為C445H711N125O146S4，原子數(shù)目1 431，消光系數(shù)(280 nm)5 500，Abs 0.1%(=1 g/L)0.535，估計(jì)半衰期為30 h(哺乳動(dòng)物的網(wǎng)狀細(xì)胞，體外)，>20 h(酵母，體內(nèi))和>10 h(大腸桿菌，體內(nèi))。不穩(wěn)定指數(shù)46.28，歸為不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)65.38，大致親水性平均值-0.548。表明NK3-4菌株EsxA為弱酸性、親水性蛋白質(zhì)，三級(jí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

2.1.2 NK3-4菌株EsxA的保守域

CDD分析表明，EsxA 含有WXG100 ESAT6保守域及WXG高度保守基序第44到46個(gè)氨基酸：W(甘氨酸)-E(谷氨酸)-G(色氨酸)，是WXG超級(jí)家族成員，該EsxA氨基酸序列及其保守域(見圖1)。

圖1 土地類芽胞桿菌NK3-4 EsxA氨基酸序列及其保守域Fig.1 Amino acide sequence and conserved domain of EsxA in Paenibacillus terrae NK3-4

2.2 NK3-4菌株EsxA 3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.1 模板篩選及模型構(gòu)建結(jié)果

將NK3-4菌株EsxA氨基酸序列提交SWISS-MODEL后，共查出417個(gè)模板，其中一個(gè)名為EsxA的蛋白與提交序列識(shí)別率30%，相似性36%，可以該蛋白為模板建模。蛋白模板是同源二聚體，沒有配基，A、B鏈(見圖2)分別覆蓋NK3-4菌株EsxA 1～90及7～90個(gè)氨基酸，覆蓋率99%。

圖2 土地類芽胞桿菌NK3-4 EsxA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模板Fig.2 Template for Paenibacillus terrae NK3-4 EsxA 3D structure prediction

2.2.2 建模質(zhì)量評(píng)估結(jié)果

建模評(píng)估表明，分子概率統(tǒng)計(jì)表明，分子概率分值1.22，沖突分?jǐn)?shù)4.42，拉氏親和99.41%，拉氏離群值0.0%，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體異常值0.0%，C-Beta偏差為0。全局性模型質(zhì)量評(píng)估顯示，QMEAN為-1.06(見圖3a)；局部模板質(zhì)量評(píng)估表明，預(yù)測(cè)的局部文庫與目標(biāo)序列預(yù)測(cè)相似性(見圖3b)；預(yù)測(cè)模型與同源蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性分析表明，與PDB結(jié)構(gòu)的非冗余集比較，標(biāo)準(zhǔn)QMEAN4分值為0.74(見圖3c)，結(jié)果表明(散點(diǎn)圖中以紅色五角星標(biāo)記)，Z得分<1，顯示該預(yù)測(cè)模型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是最佳的理想結(jié)構(gòu)。

圖3 土地類芽胞桿菌NK3-4 EsxA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模板質(zhì)量評(píng)估結(jié)果Fig.3 Assessment results of template for Paenibacillus terrae NK3-4 EsxA structure prediction

拉氏構(gòu)象分析表明，預(yù)測(cè)模型壞鍵0/1 394、壞角6/1 874，包括A66 Phe、(B8 Thr-B9 Pro)、A59 Ala、A82 Asn、B11 Gln、B49 Lys，兩個(gè)亞基中，分別有97.8%和95.6%的氨基酸殘基位于深綠色最佳允許區(qū)域，且全部殘疾均位于額外允許區(qū)域(見圖4)。表明預(yù)測(cè)模型中全部氨基酸殘基均形成了合理的二面角，構(gòu)成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

圖4 土地類芽胞桿菌NK3-4 EsxA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模板拉氏構(gòu)象圖Fig. 4 Ramachandran plots of template for Paenibacillus terrae NK3-4 EsxA注：圖中深綠色區(qū)域代表鍵角穩(wěn)定，綠色區(qū)域代表鍵角雖然不穩(wěn)定，但可在自然界存在，淡綠色區(qū)域代表鍵角不穩(wěn)定.

2.2.3 NK3-4菌株EsxA 3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

NK3-4菌株EsxA 結(jié)構(gòu)分析顯示，EsxA形成同源二聚體，其中每個(gè)亞基都由一個(gè)β折疊連接兩個(gè)α螺旋組成，這兩個(gè)α螺旋反向平行排列。二聚體中兩個(gè)亞基的肽鏈反向排列，所有N末端和兩個(gè)C末端均暴露在外。這個(gè)二聚體是不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)亞基(B鏈)自由的N端肽段暴露出來，形成3D結(jié)構(gòu)(見圖5)。

圖5 預(yù)測(cè)的NK3-4菌株EsxA激發(fā)子結(jié)構(gòu)Fig.5 Predicted structure of Paenibacillus terrae NK3-4 EsxA注：a,b為EsxA二聚體；c和d為計(jì)算出的二聚體表面電勢(shì)圖(藍(lán)色-正電荷，橙色-負(fù)電荷，紫色-中性)；b和d分別為a和c旋轉(zhuǎn)180°后的圖象；圖中標(biāo)注了每個(gè)肽鏈的C端和N端(標(biāo)注1的為A鏈，標(biāo)注2的為B鏈).

聚類分析表明，EsxA主要分成兩個(gè)大簇(見圖6a,6b)，NK3-4菌株EsxA與其中一簇中的兩個(gè)P.terrae及兩株多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)聚為一個(gè)小支，該小支內(nèi)的氨基酸序列是完全相同的，同時(shí)與其它類芽胞桿菌聚為一小簇(見圖6c)，這一小簇再依次與側(cè)短芽胞桿菌(Brevibacilluslaterosporus)，Paenibacillusyonginensis，高溫放線菌(Thermoactinomycessp)及韓氏芽胞桿菌(Bacilluskoreens)聚為一個(gè)大簇(見圖6a)；在另一個(gè)大簇中，另一些類芽胞桿菌屬菌株EsxAs聚為一小簇(見圖6b)，這兩個(gè)大簇與紅色梭菌(Clostridiumroseum)和氈毛梭菌(ClostridiumfelsineumDSM 794)最終聚到一起。可見，EsxAs在種間及屬間進(jìn)化關(guān)系是不保守的，它們被明顯的分為兩個(gè)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的類簇，EsxAs做為一類分泌型小分子蛋白，廣泛存在于包括類芽胞桿菌的微生物中，且包括NK3-4菌株在內(nèi)的類芽胞桿菌的EsxAs與動(dòng)物致病菌的毒力因子EsxAs親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)。親緣關(guān)系較遠(yuǎn)可能是EsxA功能存在差異的原因。

圖6 土地類芽胞桿菌NK3-4 EsxA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of Paenibacillus terrae NK3-4 EsxA注：樹上分類單元標(biāo)注了各蛋白在Uniport中的登錄號(hào)及來源菌種或菌株名稱，a，b，c分別為不同亞分支。

3 討 論

本文分析了類芽胞桿菌NK3-4 EsxA的基本性質(zhì)、3D分子結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為其后續(xù)研究與應(yīng)用提供了理論依據(jù)，主要表現(xiàn)在明確該蛋白的基本理化性質(zhì)，可為EsxA基因外源分泌表達(dá)條件優(yōu)化提供依據(jù)，也可為分泌表達(dá)至胞外的蛋白純化條件優(yōu)化提供參考，還可為優(yōu)化蛋白活性保持條件提供依據(jù)。3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)有助于了解EsxA的特殊結(jié)構(gòu)及功能，有助于認(rèn)識(shí)該蛋白可能存在的與其它分子之間的相互作用的位點(diǎn)，并指導(dǎo)進(jìn)行功能確認(rèn)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析可為判斷該EsxA在進(jìn)化過程中的保守性與變異性提供依據(jù)，本文將NK3-4菌株EsxA與其相似性最高的34個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析，表明這些EsxA在種內(nèi)與種間均是不保守的，說明其編碼基因變異性強(qiáng)，是一類進(jìn)化速度較快的蛋白，這也是我們認(rèn)為其在類芽胞桿菌中與在病原細(xì)菌中具有不同功能的依據(jù)。在包括NK3-4菌株在內(nèi)的類芽胞桿菌中，在類芽胞桿菌與植物進(jìn)行互作時(shí)，其EsxA是否通過分泌到細(xì)胞外參與類芽胞桿菌對(duì)植物的促生效應(yīng)，如參與宿主與植物的互作，其作用的分子機(jī)制如何，將是作者下一步研究將要揭示的答案。

4 結(jié) 論

采用生物信息學(xué)技術(shù)，明確了土地類芽胞桿菌NK3-4基因組攜帶的EsxA基因編碼的小分子分泌型蛋白的理化性質(zhì)，分析了保守域并定位了及保守基序WEG。采用建模的方式，通過對(duì)模板的一系列質(zhì)量評(píng)估，預(yù)測(cè)了蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)，并基于該EsxA氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，包括NK3-4菌株在內(nèi)的類芽胞桿菌的EsxA與致病細(xì)菌的EsxA同源關(guān)系較遠(yuǎn)，這暗示非致病菌分泌的EsxA可能具有與病原菌分泌的EsxA具有截然不同的功能。結(jié)果為NK3-4菌株在內(nèi)的非致病菌EsxA基因外源分泌表達(dá)條件、蛋白活性保持及功能的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。