干性年齡相關性黃斑變性免疫學機制的研究進展

孟 歡，金 明

?KEYWORDS:age-related macular degeneration; immune molecule; pathogenesis

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種致盲性眼底病變，可導致中心視力不可逆的喪失，是目前發達國家中老年人失明的主要原因，預計至2040年全球ARMD患者將增至約2.88億[1]，造成嚴重的經濟及社會負擔。ARMD根據臨床表現可分為滲出型(濕性)及萎縮型(干性)兩型，其中干性ARMD的患者比例約占所有ARMD患者的85%以上[2]，早期以黃斑部色素異常與玻璃膜疣生成為主要表現，而逐步進展至密集或融合的玻璃膜疣乃至晚期視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)局灶性萎縮、光感受器喪失，也稱為地圖樣萎縮(geographic atrophy，GA)[3]。目前ARMD具體的發病機制尚不完全明確，越來越多的研究表明ARMD是一種多因素導致的退行性眼底病變，涉及遺傳和環境因素之間的相互作用[4]。但人們普遍認為炎癥與免疫反應在ARMD的發病中起到關鍵作用[5]，近年來有證據表明補體、模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)、炎癥小體及多種細胞因子等免疫分子參與了干性ARMD的發病機制。因此，本文將就上述免疫分子在干性ARMD發生發展過程中的作用進行綜述，以探討關于干性ARMD的免疫學發病機制。

1補體系統

補體是人和脊椎動物血清與組織液中一類經活化后具有生物活性、可介導免疫和炎癥反應的蛋白質，補體系統是一個復雜的固有免疫監視系統，在防御病原體和維持體內平衡方面發揮重要作用[6-7]。補體蛋白以級聯方式協同作用，在不同情況下通過三種不同方式啟動—經典途徑、凝集素途徑及旁路途徑。補體在體內效應十分廣泛，參與調節感染及炎癥反應、免疫基因的表達、免疫穩態的維持等多項病理生理過程，幾乎參與了免疫反應的每一步，是連接固有免疫與適應性免疫的重要橋梁[8-10]。

研究發現，補體基因的多態性與ARMD易感性的關系密切。補體因子H(CFH)是最早被發現與ARMD發病相關的補體因子，CFH是補體旁路途徑的主要抑制劑，抑制了C3轉化酶的形成和活性，可增強RPE抗氧化應激的能力，但其基因Y402H的多態性降低了CFH中和氧化脂質的能力，顯著增加了患ARMD的風險[11-12]。隨后，補體因子B(CFB)、補體因子I(CFI)、C3、C5等多種補體基因的單核苷酸多態性與ARMD易感性的關聯也逐漸得到證實[13-14]。一項包含53 774例ARMD患者和56 973名健康對照者的Meta分析結果顯示，C2、CFB和CFH的部分基因多態性對ARMD的發展具有保護作用，而C3的基因多態性表現為ARMD的高危因素[15]。

補體蛋白自身也參與ARMD的病理過程，補體系統有規律的活化對RPE有一定保護作用[16]，其異常激活是ARMD的關鍵發病機制。Nashine等[17]研究發現ARMD患者的RPE中補體抑制因子的基因和蛋白表達顯著降低，而激活因子水平顯著升高。Toomey等[18]發現向干性ARMD模型小鼠全身注射C5a抗體，可抑制單核巨噬細胞向RPE的募集，但無法改善小鼠眼底的ARMD樣改變，提示C5a參與干性ARMD的病理過程，但此過程同時還包含多種因素驅動。目前在玻璃膜疣中已檢出CFH、CFB、C3、C5、C6、C7、C8、C9等多種補體蛋白成分，表明在干性ARMD視網膜上存在由補體系統介導的炎癥反應[19]，而CFH、CFB及C3等因子的存在說明了補體旁路途徑的激活在其中發揮了明顯作用[20]。不斷發生的補體旁路途徑的激活，導致膜攻擊復合物(MAC)在脈絡膜毛細血管和RPE上的大量沉積[21]，MAC是三條補體激活途徑的共同末端通路，是補體溶細胞生物學效應的效應復合體，可導致細胞死亡。Mullins等[22]對117例青年、老年供眼進行MAC含量檢測，發現MAC含量隨年齡及患ARMD顯著增加，在ARMD患眼中發現硬性玻璃膜疣中除MAC外還存在MAC抗體，而較大或已融合的玻璃膜疣中則未檢出MAC抗體。基于此，多項作用于補體系統的干性ARMD治療藥物臨床研究正在開展[23-24]。

2模式識別受體

模式識別受體(PRR)是固有免疫系統中可識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern， PAMP)，如脂多糖、膚聚糖或病毒RNA，以及危險相關分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)，從而激活一系列免疫通路，引發免疫反應的受體[25-26]，主要包括Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)、核苷酸寡聚結合域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)、視黃酸誘導基因Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptor，RLR)、C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLR)和黑素瘤缺乏因子-2樣受體(absent in melanoma-2-like receptor，ALR)等[27]。

NLR與干性ARMD的關系多通過炎癥小體的激活來實現，除此之外目前被發現與干性ARMD發病相關的PRR主要是TLR。TLR是一類膜結合的PRR家族，通過對核因子κB(NF-κB)信號的激活和觸發炎癥反應細胞因子的釋放介導免疫反應。TLR家族1～7、9、10在RPE上均有表達，其中TLR1和TLR3表達最高[28]。TLR3的激活具有細胞毒性，但Patel等[29]發現在氧化應激存在的情況下，TLR3的激活顯著提高了RPE細胞的活性，保護其免受氧化應激誘導的死亡，這可能和信號傳導及轉錄激活蛋白3(STAT3)水平上調，從而增強了細胞抗損傷性有關。Yang等[30]也發現，TLR3多態性rs3775291的412Phe變異體可以通過抑制RPE細胞的死亡來保護干性ARMD患者視網膜不進展至GA。此外，對TLR在ARMD中的作用主要集中于基因的研究。一項包含6項研究的Meta分析報告了TLR4與ARMD易感性的關聯性，發現其多態性rs4986790(Asp299Gly)與ARMD易感性顯著相關[31]。除此之外，TLR2、TLR3、TLR7等基因多態性也曾多次被報道與ARMD易感性相關[32-33]，但這種關聯在印度及東亞等地區人種上卻沒有發現，說明可能存在地區或人種的差異[34-36]。

3炎癥小體

炎癥小體是一類在細胞內形成的多聚體蛋白質復合物，可介導對病原體感染和組織損傷的免疫反應，是固有免疫系統的重要組成部分[37-38]。經典炎癥小體的結構由PRR等識別分子、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1的前體(pro-caspase-1)等三部分構成并根據其細胞內受體命名，主要包括NOD樣受體家族(NLRs)、AIM2樣受體家族(ALRs)、RIG-Ⅰ樣受體家族(RLRs)及Pyrin蛋白等[39-40]。炎癥小體在體內由PAMP或DAMP等激活后，ASC即啟動對caspase-1的激活及對白細胞介素(IL)-1β、IL-18前體的剪切活化，釋放至細胞外參與免疫反應過程[41-42]，這與阿爾茲海默癥、糖尿病等與衰老相關的慢性炎性過程密切相關[43-45]。

自2002年炎癥小體的概念被提出以來，NLRP3是目前為止研究最多、具有最廣泛激活劑的炎癥小體，可通過鉀外流、溶酶體失穩及活性氧(ROS)的生成等多種機制激活[46]。2012年，Doyle等[47]發現ARMD患者的亞RPE玻璃膜疣沉積成分可以激活外周髓細胞和單核細胞中的NLRP3炎癥小體和caspase-1，導致成熟IL-1β和IL-18的分泌，從而提出NLRP3參與ARMD的概念。近年來隨著研究的逐漸深入，發現NLRP3炎癥小體的活化可能是氧化應激、光損害等造成干性ARMD玻璃膜疣、視網膜變性等病理改變的關鍵機制[48]。

淀粉樣β(Aβ)和脂褐素的主要成分N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)均可在玻璃膜疣中檢出，它們通過激活NLRP3炎癥小體誘導的慢性炎癥被認為是早期ARMD的關鍵致病過程[49-51]，Tseng等[52]對具有GA的晚期干性ARMD患者眼組織進行切片染色，結果顯示病變部位NLRP3著染，進一步檢測發現患者RPE細胞中NLRP3、ASC和pro-caspase-1均高表達。Piippo等[53-54]研究發現，暴露于蛋白酶體抑制劑MG-132及巴弗洛霉素A1(BafA)的RPE細胞處于高度氧化應激狀態，釋放的ROS通過激活NLRP3炎癥小體生成IL-1β，從而觸發大量IL-8的產生，導致進一步病理性炎癥的發生，而抗氧化劑的使用阻止了這一過程的發生。Wooff等[55]對干性ARMD模型小鼠研究發現，依賴于caspase-1的炎癥小體在光氧化損傷引起的視網膜變性中參與了炎癥的發生和細胞的死亡，而caspase-1的顯著上調可能與光感受器細胞死亡水平的升高有關[56]。Kerur等[57]則認為GA的發生可能與環GMP-AMP合酶(cGAS)介導、caspase-4(在小鼠中為caspase-11)和caspase-1激活的非典型炎癥小體途徑有關。

4細胞因子

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白或多肽的總稱，用于細胞間信號傳導和相互作用。細胞因子家族包括IL、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子和生長因子等[58-59]。近年研究發現，ARMD的發生進展與細胞因子的生理功能關系密切[60]。

4.1白細胞介素IL-18、IL-17和IL-6等多種IL與干性ARMD患者RPE變性萎縮的關系密切。Ijima等[61]檢測ARMD患者血清中IL-18的含量，發現干性ARMD患者血清IL-18比對照組(無新生血管或視網膜變性等眼底病變的其他眼病人群)高約48.9%，且在小鼠視網膜下注射IL-18可引起類似干性ARMD表現的視網膜變性。在體內，IL-18還可通過炎癥小體的激活釋放，Tarallo等[62]發現核糖核酸酶DICER1的缺乏誘導人RPE細胞死亡及變性從而導致GA的發生可能是通過NLRP3炎癥小體的激活分泌IL-18，從而觸發髓樣分化因子88(MyD88)信號傳導途徑導致。Litwińska等[63]檢測ARMD患者血清多種炎性因子的含量，發現在校正了年齡、性別等存在的差異后，干性ARMD患者體內IL-6及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)濃度較高，而TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-10、IL-12均處于較低濃度。Cao等[64]研究了干性ARMD患者血漿細胞因子與CFH基因Y402H多態性的關系，發現CFH-Y402H多態性純合子高危CC變異患者的IL-6水平顯著高于其他基因型患者，IL-18水平高于CT變異患者，血液中較高濃度的細胞因子可能會使局部視網膜環境處于促炎狀態，這也解釋了為什么CFH基因CC變異患者比TT變異患者具有更高的ARMD進展風險。

IL-17家族中IL-17A與IL-17RC在ARMD患者眼中高表達，可能與ARMD的發展相關。Ardeljan等[65]檢測了晚期ARMD患者眼組織的IL-17含量，發現與正常組織比，黃斑部IL-17A表達平均高14～20倍，IL-17RC高47～93倍，同時發現經沉默RNA轉染、降低了IL-17RC表達能力后，IL-17A活性降低，并顯著降低了caspase-9和caspase-3的激活，抑制了對RPE的細胞毒性。另有研究發現，IL-17RA的高表達及對下游促炎細胞因子的上調或許是RPE在氧化應激時發生變性或死亡的關鍵機制[66]。

4.2趨化因子及其受體多種趨化因子及其受體被證實與干性ARMD RPE萎縮及GA的發生有關。C-C型趨化因子受體3(CCR3)是CCL5、CCL7、CCL11、CCL24、CCL26的受體，Kuse等[67]通過動物實驗發現其與光照導致的感光細胞死亡有關，對CCR3的抑制降低了ROS的水平和由光誘導的caspase-3、caspase-7的活化，減緩了小鼠感光細胞的死亡速率。CX3CR1是趨化因子亞家族CX3C唯一成員CX3CL1的特異性受體，近年來被證實與ARMD的發病關系密切[68]。Combadière等[69]發現ARMD患者眼底視網膜變性部位有大量小膠質細胞的聚集，且CX3CR1表達陽性，并且在玻璃膜疣中發現了CX3CR1沉積物，因此推斷CX3CR1陽性小膠質細胞的積聚可能與玻璃膜疣形成、光感受器變性有關。而敲除了CX3CR1基因的小鼠視網膜下同樣出現脂質膨脹的小膠質細胞沉積，被認為是干性ARMD玻璃膜疣現象的起源[70]。此外，CCL2、CCR2、CX3CR1等多種趨化因子或受體的基因多態性都表現了與干性ARMD的相關性[71-72]。

基于趨化因子與視網膜變性的密切聯系，趨化因子基因敲除小鼠被廣泛用于制作干性ARMD的實驗模型。CCL2和CX3CR1基因缺陷的小鼠均被發現眼底出現了玻璃膜疣生成、光感受器萎縮及視網膜變性等干性ARMD的典型表現[73-74]。因此，Tuo等[75]制作了CCL2-/-/ CX3CR1-/-雙基因敲除(DKO)小鼠，通過對眼底組織病理學及蛋白組學分析，發現DKO小鼠在6周齡時即表現出視網膜變性等干性ARMD癥狀，Ross等[76]進一步檢測其眼免疫蛋白的水平，發現DKO小鼠與人類ARMD患者顯示出相似的免疫病理學特征，支持CCL2-/-/ CX3CR1-/-作為人類干性ARMD的合適模型。

5小結

干性ARMD是一種由多因素造成的復雜眼病，病因及發病機制尚不完全明確，且目前尚無有效療法。盡管其具體發病原因不明，但炎癥及免疫反應在其發病機制及疾病進展過程中起到了推動作用，而炎癥反應的完成很大程度依賴于免疫分子的活化與信號轉導。因此，深入研究各免疫分子在干性ARMD發生發展過程中的具體功能及作用途徑，有助于闡明干性ARMD的機制，為干性ARMD的治療提供新的思路。