循環游離核酸作為表觀遺傳標記在精準醫療中作用的研究進展*

李 瓊 綜述，張 艷 審校

(1.蘭州新區第一人民醫院重癥醫學科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫院日間手術中心，甘肅 蘭州 730000)

精準醫療指應用多種檢測手段，根據患者的臨床病理指標、分子生物學數據等信息，為患者“量身定制”個體化的疾病診療和預防方案，使患者獲得最適宜的治療效果和最低不良反應的一種醫療服務模式。循環游離核酸(cfNAs)是單鏈或雙鏈核酸的混合物，指在人體外周血液中游離于細胞外的核酸片段[1]。cfNAs包括循環游離DNA(cfDNA)、游離微小RNA(cfmiRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環狀RNA (circRNA)等[2]。近年來，cfNAs作為表觀遺傳生物標志物在多種疾病的診斷及預后評估中備受關注，同時也成為精準醫療不可或缺的研究重點。本文就cfNAs在癌癥、產前診斷等疾病中的作用進行簡要綜述，旨在為cfNAs在精準醫療中的發展提供新的方向。

1 概 述

精準醫療是一個建立在了解個體遺傳、生活環境及行為方式基礎上的新興疾病治療和預防方法，精準醫療通過詳細了解個體的基因序列，可以對不同患者的基因組進行對比參考[3]。游離細胞表觀基因組圖譜(CFEA)數據庫和5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)模式全基因組分析提供的cfDNAs表觀遺傳標記信息，表明cfDNAs上的核小體定位和占有率有較高的診斷敏感性和特異性[4-5]。此外，組蛋白修飾和RNA標記作為新型標志物也受到越來越多的關注[1,6]。精準醫療實際上是21世紀醫療模式的升級版，是以個體化醫療為基礎，隨基因組測序技術和生物信息與大數據交叉應用的快速進步而發展起來的新型醫學概念與醫療模式。精準醫療的最終目標是實現精準治療，作為表觀遺傳標記的cfNAs，因其具有較高的穩定性及組織特異性，在癌癥、產前診斷和妊娠相關疾病中的早期診斷及預后評估中發揮重要作用。并且，隨著各種檢測技術的發展，cfNAs在其他疾病如自身免疫疾病、神經系統疾病等也顯示出其在表觀遺傳標記方面的巨大潛能。

2 cfNAs與癌癥

精準醫療指出，DNA序列的個體變異與疾病病因之間存在緊密聯系。近年來，血清或血漿中的cfNAs充當“液體活檢”在癌癥篩查、提供預后信息和腫瘤基因組分析等方面發揮了重要作用[4]，具有多種臨床目的的實際和潛在應用，避免了對腫瘤組織進行活檢的必要性[5-6]。cfDNA可能會記錄不同種類腫瘤的特異性DNA畸變、基因擴增、抑癌基因啟動子區域的病毒致癌DNA超甲基化和長散布核元件-1的甲基化不足[7-8]。

2.1cfDNA在癌癥診斷和治療中的作用 循環腫瘤DNA(ctDNA)是原發或繼發性腫瘤細胞經過凋亡或壞死后釋放到血液的cfDNA亞群。癌細胞發生壞死會產生較長的不均勻DNA片段，而發生凋亡則產生較短的DNA片段，因此，血流中較長DNA片段水平的增加被視為惡性腫瘤診斷的潛在標志物[9]。此外，高水平的cfDNA已被證明是結直腸癌[10]、胰腺癌[11]、腎癌[12]、乳腺癌[13]、肺癌[14]、黑色素瘤[15]等疾病預后較差的指標。

研究表明，在非小細胞肺癌(NSCLC)早期階段，cfDNA片段中ctDNA的數量較晚期階段低10倍，這個結果可用于沒有組織樣本評估和測試表皮生長因子受體(EGFR)基因突變狀態時預測NSCLC的發展[16]。血液和糞便中DNA啟動子高甲基化的分析可作為大腸癌(CRC)早期診斷的非侵入性方法。已有研究觀察到MGMT、RASSF2A、Wif-1、NGFR和SEPT9等基因的異常甲基化，可用作為CRC患者的診斷生物標志物[17]。肝細胞癌(HCC)的早期檢測到INK4A啟動子區域高甲基化，其可作為HCC早期診斷和預測治療方面有價值的生物標志物[18]。此外，血漿cfDNA中抑癌基因HIC-1啟動子區甲基化水平,在乳腺癌診斷中有一定參考價值[19]。另有研究表明，ZNF692的表達情況與腎透明細胞癌(ccRCC)患者的預后密切相關，檢測ZNF692的表達水平可用于預測ccRCC的復發、轉移，并進行早期干預[20]。同樣地，SET1在乳腺癌轉移、肺癌和大腸癌發生中發揮重要作用。有研究表明，SET1A和SET1B與H3K4啟動子甲基化有關。因此，ctDNA在癌癥的早期診斷或篩查及預后的評估應用都受到廣泛關注，但其在當前測定的特異性和靈敏度方面仍面臨挑戰，需更多的臨床研究去證實[21]。

2.2cfmiRNA在癌癥診斷和治療中的作用 miRNA在多種癌癥中表達異常，在許多癌癥發展過程中發揮作用，如腫瘤的增殖、轉移和耐藥等[22-26]。陳丹丹等[22]研究發現，HCC患者血清miRNA-21、miRNA-192與血清腫瘤標志物α-L-巖藻糖苷酶(AFU)呈正相關，對于HCC具有良好的診斷價值。此外，在神經膠質瘤和前列腺癌患者中鑒定出的TEP含有EGFRv Ⅲ和前列腺癌抗原3(PCA3)，已被證明是癌癥相關的RNA生物標志物[27]。隨著miRNA的作用被不斷發掘并證實，越來越多的miRNA應用于癌癥的診斷和治療中。比如，血清中的miR-135a，miR-106a、miR-200c、miR-605和miR-433可以預示患前列腺癌的高風險性[28]，與早期乳腺癌患者相比，轉移性乳腺癌患者miR-21、miR-23b、miR-200c和miR-200b的表達水平均上調[29]。此外，miRNA-143和miRNA-221被證實為直腸癌抑癌因子,對直腸癌的診斷具有重要意義[25]。LOOSEN等[26]研究分析，膽管癌患者血清miR-29、miR-122、miR-155和miR-192水平升高。雖然術前miRNAs水平不適合作為生存預后標志，但術后血清miR-122水平的降低與較好的患者預后顯著相關。最近也有研究表明，血清miR-125a-5p表達水平與NSCLC臨床TNM分期呈負相關，可成為輔助早期診斷的重要生物分子標志物[30]。因此，cfmiRNAs對癌癥的早期診斷及預后判斷具有一定的臨床價值。

2.3癌癥精準醫療中的cfNAs 癌癥的精準治療是精準醫學的最終目的，是提高癌癥患者生存率的有效手段，“早發現、早診斷”是精準治療的關鍵,而精準篩查是早期診斷、精準治療的前提。精準腫瘤學是一種包括腫瘤分子特征分析以鑒定有效治療策略的方法。使用轉移瘤和原發性腫瘤的全基因組測序來確定個性化的治療選擇，并通過對患者進行前瞻性隨訪來幫助指導臨床決策[26]。基于基因檢測和測序技術的精準醫療在其診斷治療具有很強的相關性，而其在疾病病因預測方面尚需進一步的發展。

研究表明，5hmC的水平在腫瘤的基因調節方面具有至關重要的作用。并且，整個基因組中5hmC水平的總體降低可以導致癌癥患者的臨床結局較差[31]。表觀遺傳學變化在肺癌體外模型中引入了常見的基因突變，基于表觀遺傳學的診斷可以檢測到早期的癌變信號，因此可以在癥狀進展之前為臨床干預提供可能性[32]。

3 cfNAs與產前診斷和妊娠相關疾病

自從發現孕婦外周血漿/血清中存在著胎兒cfNAs以來，孕婦血液中cfNAs的檢測作為一種非侵入性產前篩查，避免了羊膜穿刺術和絨毛取樣等侵入性檢查相關風險的發生，且孕婦外周血中胎兒cfNAs水平豐富、出現時間早且產后迅速清除,更加適用于產前診斷[33]。此外，當發生異常妊娠時,孕婦血漿總DNA及胎兒DNA水平均可出現不同程度的異常升高[34]。

3.1胎兒cfDNA在產前診斷和妊娠相關疾病中的作用 cfDNA甲基化標志物可作為定性標記，用于估計胎兒性別，RhD基因狀況和父系遺傳多態性期間的假陽性[35]。cfDNA甲基化能夠調節腫瘤抑制基因RASSF1A、APC和PRKCDBP的表達，其對于正常胎盤的發育至關重要，而這些基因啟動子區域的高甲基化可導致其表達下調，這一調節與妊娠滋養細胞疾病(GTD)的發生有關[36]。同樣，相對于正常妊娠的健康對照組，在孕周15～28周時，妊娠合并宮內生長受限(IUGR)、先兆子癇(PE)和前置胎盤(PP)的患者中RASSF1A的超甲基化程度顯著升高[37]。由于母體血漿中c-myc啟動子的甲基化水平與子癇前期的甲基化狀態相似，因此c-myc可能是PE另一個有前途的特定胎兒表觀遺傳標志物[38]。

3.2cfRNA在產前診斷和妊娠相關疾病中的作用 胎兒cfmiRNA在產前診斷中充當基于表達的新型表觀遺傳標記，母體血清中檢測出的許多差異表達的胎兒cfmiRNA已被用來診斷先天性心臟病[39]。有研究表明，與滋養細胞遷移和侵襲受損有關的miRNA(miR-195、miR-276C、miR-278a-5p和miR-210)和與血管生成受損有關的miRNA(miR-210、miR-21和miR-22)與PE有關[40]。此外，妊娠糖尿病中報告的環狀miRNA異常表達也可作為早期診斷的潛在生物標志物[41]。

CircRNA和lncRNA可用于先天性心臟病的產前診斷[42]。GU等[43]應用基因芯片技術篩選了lncRNA圖譜，通過qPCR對lncRNA的差異表達進行驗證，發現在室間隔缺損(VSD)和房間隔缺損(ASD)的患者血漿樣本中，ENST 00000436681和ENST 00000422826表達上調，而AA584040、AA709223和BX478947表達下調，表明許多lncRNA與先天性心臟病有關。cfDNA分析已在臨床環境中使用，而lncRNA、cirRNA和miRNA的使用尚處于研究階段，該領域需要大量人群進行深入研究，以開發孕婦血液中胎兒表觀遺傳標記的新臨床應用，進而為精準醫療的發展提供更可靠的決策依據。

4 cfNAs與其他疾病

4.1cfNAs在自身免疫性疾病中的作用 表觀遺傳修飾在自身免疫疾病的發生發展中起著重要作用。狼瘡患者的外周血單核細胞(PBMC)和CD4+T細胞中存在異常的DNA脫甲基化。類風濕關節炎(RA)患者的外周血單核細胞(PBMC)中白細胞介素-6(IL-6)和ERα啟動子低甲基化與IL-6的過度表達和ERα信號的過度活躍有關。此外，在系統性硬化癥(SSc)患者的PBMC中，Th17相關基因(如RORC1和RORC2)的甲基化與炎癥參數相關[44]。最近的研究表明，RA患者的PBMC中約有600個差異表達的cfRNAs[45]。SLE患者血漿中的200多種cfRNAs和復發緩解型多發性硬化癥(RR-MS)患者的PBMC中約有400多種cfRNAs，其表達較健康志愿者有顯著差異。因此，通過不同cfRNAs與其他過渡標志物結合，可幫助檢測，提高自身免疫性疾病臨床診斷的效率[46]。

4.2cfNAs在神經系統疾病中的作用 研究表明，無論是整體水平還是特定位點水平，CpG二核苷酸處的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5hmC是各種神經退行性疾病的潛在表觀遺傳標記[47]。在阿爾茨海默病(AD)患者中，整體水平上5mC和5hmC水平會升高或降低[48]。此外，顱腦外傷后患者血清中腦源性的cfDNA表達增加。并且，在肌萎縮性側索硬化癥(ALS)患者的血漿中也發現了位于RHBDF2基因啟動子-增強子區域的甲基化差異區域[49]。因此，腦脊液中差異表達的miRNA，表明不同的神經系統損傷。

綜上所述，通過分析血液或血清中cfNAs的動態變化來檢驗癌癥發展是一個新興的研究領域。根據癌癥患者的cfNAs或ctDNA甲基化水平進行診斷和治療應用于臨床前，仍需更多的研究。目前，與cfNAs相關的表觀遺傳修飾在癌癥和產前篩查的臨床實踐中應用較多，但是對于其他疾病如神經系統疾病、自身免疫性疾病等的研究數據有限。未來需要在不同生理和病理條件下對cfNAs中的表觀遺傳標記進行全面的數據分析，并在基于人群的大型研究和疾病隊列中進一步測試所選標記，以進一步推進精準醫療的發展。