基于生物信息學分析的呼吸機相關肺損傷免疫因子及信號通路預測

劉歡，曹袁媛，張雷，劉學勝，顧爾偉

目前，機械通氣（mechanical ventilation，MV）作 為重要的生命支持手段之一，在全身麻醉和危重病人的治療中發揮著重要作用。不恰當的機械通氣可能導致嚴重的肺部并發癥，如呼吸機相關肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）。既往研究表明，長時間的機械通氣可誘導局部肺組織產生多種促炎介質，破壞肺泡毛細血管屏障功能，導致肺水腫［1-2］。然而，機械通氣所致肺損傷的機制尚不清楚，也無治療VILI的好方法。VILI引起的嚴重術后肺部并發癥可導致住院時間、ICU住院率、死亡率和經濟負擔顯著增加［3-4］。因此，探討VILI相關免疫因子和信號通路對于預防和改善呼吸機通氣病人術后肺功能具有重要意義。本研究應用生物信息學分析方法對VILI基因表達譜進行分析，篩選VILI發生過程中重要的免疫因子及可能的信號通路。

1 資料與方法

1.1 一般資料在美國國家生物技術信息中心（http：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gds∕）的基因表達總庫（GEO）檢索2019年12月前與VILI相關的基因表達譜數據，下載GSE86229基因表達譜數據進行后續分析，該芯片表達譜基于GPL6246平臺（MoGene-1_0-st）Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array。選擇基因表達譜中兩組數據，非機械通氣組（對照組）樣本5個，高潮氣量組樣本5個。此外，從Bioconductor（www.bioconductor.org）下 載 探 針 注 釋 包（mogen10sttransptcluster.db）用于將數據的探針名稱映射為基因名稱［5］。

1.2 研究方法

1.2.1數據處理使用R軟件中的“affy”包通過RMA算法對基因表達譜原始數據進行預處理，包括背景校正、歸一化和表達值計算，并繪制原始數據和處理后數據的箱線圖，對數據進行可視化處理。然后，使用R軟件的“annotate”包將兩組數據探針名稱注釋為基因名稱進行后續分析［6］。對于數據中映射多個探針名稱的基因，選擇最大探針表達值作為該基因的表達值。

1.2.2差異表達基因分析通過R軟件的“limma”包篩選DEGs［7］，標準為adj.P.val＜0.05和|Log2FC|＞1。然后，通過“Pheatmap”包（https：∕∕cran.r-project.org∕package=pheatmap）進行聚類分析和繪制熱圖，進一步分析DEGs。

1.2.3DEGs的富集分析使用基因本體論（gene ontology，GO）分析對基因進行功能注釋［8］，包括生物過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cellular component，CC）三個方面。京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路數據庫包含許多生化通路，可以為生命科學研究提供更多的生物信息。使用在線數據庫Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（DAVID；version 6.8）進行GO和KEGG分析［9］。閾值設置為Bonferroni校正P＜0.05，富集計數＞2。

1.2.4蛋白質相互作用網絡分析在線數據庫STRING（string；version11.0；http：∕∕www.string-db.org∕）可從已知和預測的蛋白質數據中獲得蛋白質全面相互作用信息［10］。研究中選擇高置信系數（＞0.7）作為選擇標準，通過Cytoscape（3.5.0）軟件進行網絡可視化［11］，并通過插件cytoHubba尋找關鍵蛋白質以確定與VILI發生相關的關鍵蛋白質和關鍵基因。

2 結果

2.1 數據處理本研究中，基于GPL6246平臺的GSE86229基因表達譜芯片經過標準化和注釋，共獲得了20 310個基因。繪制對照組和高潮氣量組所有基因標準化前后的對數表達值箱線圖（圖1）。標準化后，組內和組間數據的中位數水平近似同一水平，表明不同芯片間的數據具有可比性，可以進行后續分析。

圖1 呼吸機相關肺損傷基因表達譜的數據預處理：A為標準化前數據；B為標準化后數據

2.2 差異表達基因分析在對照組和高潮氣量組之間共篩選出337個DEGs（高潮氣量組∕對照組），其中包括279個上調基因和58個下調基因（圖2A）。通過構建基因熱圖進行聚類分析（圖2B），結果顯示DEGs主要聚類為兩組：對照組和高潮氣量組，與基因表達譜芯片分組一致，表明納入的組內樣本之間存在較高的同質性。

圖2 呼吸機相關肺損傷基因表達譜差異表達基因分析：A為火山圖；B為熱圖

圖3 呼吸機相關肺損傷基因表達譜差異表達基因編碼的蛋白質相互作用網絡中關鍵蛋白質分析

2.3 DEGs的富集分析337個DEGs主要富集在46個GO和13個KEGG類型中（見表1）。結果表明，DEGs顯著分布于細胞外間隙和細胞質膜外側，主要參與細胞對炎癥、脂多糖和中性粒細胞趨化的生物過程，以及具有細胞因子活性、趨化因子活性和脂多糖結合的分子功能。KEGG分析表明DEGs主要富集在腫瘤壞死因子和細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路途徑中。

表1 呼吸機相關肺損傷基因表達譜差異表達基因GO和KEGG富集分析（前3位）

2.4 蛋白質相互作用分析使用STRING數據庫對DEGs進行分析，將獲得蛋白質相互作用網絡數據導入Cytoscape。刪除網絡無連接的節點后，獲得158個節點（蛋白質）和745個PPI邊。通過cytoHubba插件計算網絡中關鍵蛋白質，不同算法獲取的關鍵蛋白質見表2；取各算法結果交集，最終獲得白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、整聯蛋白αM（ITGAM）、白細胞介素1β（IL-1β）和Toll樣受體2（TLR-2）作為關鍵蛋白質。

表2 cytoHubba不同算法篩選的呼吸機相關肺損傷基因表達譜關鍵蛋白質

3 討論

隨著目前社會科學技術的飛速發展，基因芯片技術已成為研究生物科學的重要基石。基因芯片利用高通量分子生物學技術同時檢測數以萬計的基因表達情況，并可以通過生物信息學分析處理大量煩瑣的生物數據，為生命科學研究提供一定的幫助［12］。目前機械通氣所致肺損傷的機制尚不清楚，因此明確VILI相關免疫因子和信號通路對于預防和改善呼吸機通氣病人術后肺功能具有重要意義。本研究利用生物信息學方法對基于GPL6246平臺的小鼠VILI肺組織樣本基因表達譜（GSE86229）進行分析，篩選了337個DEGs。通過富集分析明確DEGs參與炎癥反應過程；KEGG分析表明DEGs主要富集在TNF信號通路途徑。最終，通過蛋白質相互作用網絡確定IL-6、TNF-α、ITGAM、IL-1β和TLR-2為關鍵蛋白質，并確定IL-6、TNF-α、ITGAM、IL-1β和TLR-2為VILI發展的關鍵基因。

機械通氣已廣泛應用于各種臨床環境，但大量的實驗和臨床證據表明盡管有保護性的小潮量通氣，機械通氣仍可導致VILI的發生［13］。本研究通過生物信息學分析發現，DEGs主要參與細胞對炎癥、脂多糖和中性粒細胞趨化的生物過程，以及具有細胞因子活性、趨化因子活性和脂多糖結合的分子功能。與本研究結果相似的是，雖然很多因素被認為是VILI的可能危險因素，但炎癥反應被認為是共同的途徑［14-15］。研究普遍認為機械通氣所致的損傷，包括氣壓傷、容積傷和肺不張傷，很可能發展為局部的炎癥失衡，甚至全身性炎癥反應；表現為中性粒細胞浸潤增加、肺泡壁增厚與透明膜形成等［16］。

IL-6作為一種功能廣泛的炎性因子，是炎癥介質網絡的重要組成部分。小鼠高潮氣量與低潮氣量機械通氣相比，可導致IL-6水平顯著升高；臨床研究也發現給予大潮氣量機械通氣病人與接受小潮氣量機械通氣病人相比，血漿中IL-6水平顯著升高高［17］。此外，不恰當的機械通氣也導致VILI的病人肺泡灌洗液中IL-6水平升高［18］。Meta分析結果顯示IL-6基因與急性肺損傷的相關性有統計學意義［19］。

炎癥細胞產生高水平的促炎細胞因子（如TNF-α）進一步加重肺損傷［20-22］。在VILI動物模型中，高潮氣量及周期性的氣道關閉和重新開放都與肺泡灌洗液中TNF-α水平的增加有關。高潮氣量機械通氣顯著增加TNF-α的產生；提示TNF-α的上調在機械拉伸引起的肺部炎癥中發揮關鍵作用［23］。Veldhuizen等［24］對離體小鼠肺臟進行潮氣量為20 mL∕kg的機械通氣可顯著增加支氣管肺泡灌洗液中TNF-α水平。此外，通過抗體阻斷TNF-α功能可減輕肺泡表面活性物質缺乏大鼠的組織病理學損傷［25］。這些數據提示TNF-α在VILI中的關鍵作用。

既往研究發現IL-1β與VILI密切相關，肺內IL-1β的水平在機械通氣過程中顯著升高［26-27］。小鼠使用高潮氣量機械通氣可導致支氣管肺泡灌洗液中IL-1β水平明顯升高［28］。此外，高潮氣量機械通氣增加血漿中炎性因子IL-1β水平［29］。然而，對敲除IL-1αβ基因后的小鼠進行機械通氣并沒有表現出這種細胞因子的增加［26］。這些數據表明IL-1β參與了VILI的發生和發展。ITGAM為整聯蛋白αM，主要在單核細胞、粒細胞和巨噬細胞中表達，并參與吞噬、細胞介導的殺傷、趨化和細胞激活功能［30］。細胞受到刺激時，ITGAM表達量增加。大鼠VILI模型中肺灌洗液發現單個巨噬細胞ITGAM的表達增加［31］。TLR-2作為天然免疫系統中的一種模式識別受體，在VILI模型中表達明顯上調，從而導致肺部炎癥［32］，使用TLR-2單克隆抗體拮抗TLR-2后可減輕VILI模型中肺臟的炎癥反應［33］。

本研究中KEGG分析表明DEGs主要富集在TNF信號通路途徑。TNF-α是一種主要由感染或傷害的反應激活的巨噬細胞分泌的促炎細胞因子［34］，其在炎癥、免疫反應和多種病理生理過程中都起到重要的調節作用。TNF-α的這些功能均是通過TNF-α在細胞膜表面的受體介導的。TNF-α的受體有兩種，即Ⅰ型TNF受體（TNFR1）和Ⅱ型TNF受體（TNFR2）［35］。這兩種受體在不同類型的細胞中均有表達，TNFR1主要在上皮細胞和成纖維細胞中表達，而TNFR2在淋巴細胞和巨噬細胞中表達。TNF-α與TNFR1結合不僅傳遞細胞毒信號，還傳遞抗凋亡信號，而TNF-α與TNFR2結合僅傳遞抗凋亡信號［35］。p-38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細胞內廣泛存在的絲蘇氨酸蛋白激酶超家族，是將細胞質的信號傳遞至細胞核并引起細胞核發生變化的重要物質。環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）作為真核細胞核內轉錄因子，通過磷酸化與去磷酸化的形式來實現其調節細胞轉錄功能，其與細胞生長、增殖、分化、周期調控等細胞生物活動密切相關。目前已報道CREB在炎癥過程的關鍵作用［36-37］。因此，我們推測TNF-α可能與細胞膜TNFR1結合，通過MAPK途徑進行信號轉導，最后經核內轉錄調節因子CREB調控VILI發展的炎癥過程。

4 結論

綜上所述，本研究采用生物信息學分析方法篩選了VILI發生過程中的337個DEGs，通過蛋白質相互作用分析確定IL-6、TNF-α、ITGAM、IL-1β和TLR-2是VILI發生的關鍵免疫因子；KEGG分析表明DEGs主要富集在TNF信號通路途徑，推測TNFR1-p38-CREB可能是VILI發展的信號通路之一。然而，本文的結果存在一定的局限性，需要未來進一步的研究結果進行驗證。

（本文圖2，3見插圖1-1）