微孔藥敏檢測(cè)法檢測(cè)耐多藥結(jié)核病33例耐藥分析

秦萬(wàn)，王瓊，歐維正，王明棟，徐勇

耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）是指結(jié)核病病人感染的結(jié)核分枝桿菌體外細(xì)菌耐藥的藥敏試驗(yàn)（DST）證實(shí)至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核病［1-3］。

結(jié)核耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，包括結(jié)核菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成變化、結(jié)核菌自身的藥物外排泵系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)藥物靶編碼基因發(fā)生突變［4］。我國(guó)是耐藥結(jié)核病流行國(guó)家之一［5-11］。而貴州省是我國(guó)結(jié)核病高發(fā)病率、高耐藥率及高負(fù)擔(dān)率［12］。同時(shí)也是結(jié)核病高死亡率的地區(qū)之一。藥敏檢測(cè)技術(shù)的不斷完善和提高，由以前幾種抗結(jié)核藥藥敏試驗(yàn)到現(xiàn)在十幾種藥一次性就可以檢測(cè)到藥敏的耐藥情況，而且7～14 d就可以出報(bào)告，這就是筆者以下重點(diǎn)介紹的MicroDSTTM微孔板法一次性可檢測(cè)16種抗結(jié)核藥藥敏情況。該法在本地區(qū)的推廣使用有利于MDR-TB的發(fā)現(xiàn)及有效藥物篩選應(yīng)用，為臨床指導(dǎo)用藥，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年1月至2019年11月貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心羅氏比例法藥敏試驗(yàn)隨機(jī)篩選的MDR-TB病人各種標(biāo)本羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性菌株33例進(jìn)行16種常用抗結(jié)核藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中男25例，女8例，年齡范圍18～73歲，平均年齡34.70歲。

1.2 試劑與儀器MicroDSTTM微孔板藥敏檢測(cè)試劑盒（培養(yǎng)法）由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供；細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀由體必康生物有限公司提供；YK-909分枝桿菌微孔板藥敏讀儀、YK-96小型全自動(dòng)移液平臺(tái)均由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供。采用一、二線抗結(jié)核藥，包括四種一線藥為利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇和12種二線藥為利福噴汀、左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、丙硫異煙肼、力克肺疾、莫西沙星、對(duì)氨基水楊酸、克拉霉素、利福布汀、卡拉霉素、氯法齊明。

1.3 檢測(cè)方法MicroDSTTM微孔板藥敏檢測(cè)：取出凍干雜菌抑制劑旋開(kāi)瓶蓋，將無(wú)菌稀釋液全部加入充分混勻后加100 μL于藥敏培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)蓋好蓋充分混勻，用無(wú)菌吸管吸取180 μL培養(yǎng)液加入到A1或E1、B1和F1孔，分別作為1∕10、1∕100參照孔，再吸取200 μL培養(yǎng)基加入到C1、D1或G1、H1作為陰性對(duì)照孔；將培養(yǎng)菌株通過(guò)超聲比濁1.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝缓蠹?00 μL于培養(yǎng)基中混勻，然后給每孔加200 μL含菌液的藥敏培養(yǎng)基（除上述4孔），再吸20 μL至A1或E1孔作為1∕10參照孔，從A1至E1孔吸取20 μL至B1或F1作為1∕100參照孔，蓋上盒蓋，最后用透明膠布沿周邊封三圈后放入自封袋密閉封口，置37℃培養(yǎng)7～14 d肉眼觀察或通過(guò)YK-909判讀，報(bào)告按照防癆規(guī)程執(zhí)行。

1.4 質(zhì)量控制本試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)減毒株H37Rv（ATCC25277）的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照孔經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)好，接種到藥敏孔經(jīng)培養(yǎng)后完全受抑制，鑒定為結(jié)核分枝桿菌，藥敏測(cè)定為敏感；對(duì)陰性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果為陰性。同時(shí)，如遇個(gè)別菌活力較弱、菌液濃度調(diào)節(jié)過(guò)小或菌懸液添加過(guò)少等特殊菌株將會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或不出結(jié)果，則應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間直至21 d時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照孔及藥敏孔無(wú)變化，則應(yīng)傳代培養(yǎng)，重做實(shí)驗(yàn)。除此之外，菌懸濃度過(guò)高或菌懸液添加過(guò)多，則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，故操作規(guī)程務(wù)必嚴(yán)格按照微孔板藥敏說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 藥敏檢測(cè)的6種抗結(jié)核藥結(jié)果MDR-TB病人菌株33例在比例法藥敏檢測(cè)的6種抗結(jié)核藥結(jié)果對(duì)比，見(jiàn)表1。

表1 MDR-TB菌株33株的MicroDSTTM微孔板和羅氏比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 微孔板藥敏法檢測(cè)的33株MDR-TB其余10種二線耐藥率利福噴丁78.8%（26∕33）；阿米卡星3.0%（1∕33）；卷曲霉素3.0%（1∕33）；丙硫異煙胺24.2%（8∕33）；力克肺疾33.3%（11∕33）；莫西沙星3.0%（1∕33）；對(duì)氨基水楊酸21.2（7∕33）；克拉霉素12.1%（4∕33）；利福布汀18.2（6∕33）；氯法齊明3.0%（1∕33）。

2.3 MicroDSTTM微孔板法對(duì)33株MDR-TB菌株檢測(cè)的總耐藥情況4種一線抗結(jié)核藥總耐藥數(shù)為93，耐藥率為：70.5%（93∕132）；12種二線抗結(jié)核藥總耐藥數(shù)為81，耐藥率為：20.5%（81∕396），一二線總耐藥率為：33%（174∕528）。（33×4=132、33×12=396分別表示33株菌株對(duì)4種一線和12種二線抗結(jié)核藥的總藥數(shù)；174則表示一二線耐藥的總數(shù)，即93+81=174，33×16=528則表示33株菌株對(duì)16種抗結(jié)核藥的總藥數(shù)）。

3 討論

MDR-TB是造成全球結(jié)核病疫情回升的重要因素之一，也是結(jié)核病防治的難題，治療難度大［13］。本研究對(duì)以上16種抗結(jié)核藥進(jìn)行藥敏測(cè)試以便了解本地區(qū)MDR-TB病人的耐藥情況。從以上結(jié)果可以看出，這兩年MDR-TB病人的耐藥情況仍然很?chē)?yán)重，而且有的病人多種耐藥還很?chē)?yán)重，MDR-TB可進(jìn)一步發(fā)展為廣泛耐藥結(jié)核病（XDR-TB），即結(jié)核病病人感染的Mtb經(jīng)體外DST證實(shí)在耐多藥的基礎(chǔ)上至少同時(shí)對(duì)一種氟喹諾酮類(lèi)和一種二線注射類(lèi)抗結(jié)核藥物耐藥［14］。治療的難度進(jìn)一步地加大，所以筆者以MicroDSTTM微孔板法檢測(cè)結(jié)核藥較多的試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行耐多藥分析，以便共同探討和如何提高耐多藥結(jié)核病人的治愈率。

羅氏培養(yǎng)比例法稱(chēng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”法，由于檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要4～6周方能出結(jié)果，而且檢測(cè)的藥敏種數(shù)也不多，絕對(duì)濃度法也同樣需要較長(zhǎng)的檢測(cè)周期，這給結(jié)核的治療輔助作用帶來(lái)了一定的難度。而MicroDSTTM微孔板MIC藥敏屬于表型藥敏的升級(jí)換代產(chǎn)品，具有一定的技術(shù)先進(jìn)性，故MicroDSTTM微孔板法的出現(xiàn)和推廣對(duì)結(jié)核治療的輔助便起到了很好的作用，與傳統(tǒng)比例法也有很高的符合率，因而對(duì)二線抗結(jié)核藥藥敏的檢測(cè)是可靠的，本研究結(jié)果也符合這一點(diǎn)。預(yù)期的效果也得到了廣大臨床醫(yī)生的認(rèn)可［15］。此法操作簡(jiǎn)單，便于自動(dòng)加樣和批量檢測(cè)，特別是對(duì)于我們結(jié)核病人較多的專(zhuān)科醫(yī)院，需要做藥敏的病人較多，帶來(lái)更為方便的一種檢測(cè)方法，不僅如此，該法的檢測(cè)周期也比傳統(tǒng)的比例法或絕對(duì)濃度法短，只需7～14 d就可出檢驗(yàn)報(bào)告，這便是MicroDSTTM微孔板法的優(yōu)點(diǎn)。與此同時(shí)，據(jù)李靜等［16］等報(bào)告，BACTEC-MGIT960法的藥敏檢測(cè)一線藥結(jié)果與羅氏比例法藥敏檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比結(jié)果比MicroDSTTM法藥敏檢測(cè)一線藥與傳統(tǒng)的羅氏比例法對(duì)比的結(jié)果的藥物敏感性、特異性及符合率都高，而且兩者之間有比較好的一致性，可見(jiàn)MicroDSTTM的技術(shù)已接近BACTEC-MGIT法的技術(shù)。由于此檢測(cè)方法是最近幾年投入使用的新技術(shù)，以前不足的地方也有了很大的提高，對(duì)利福平與異煙肼的檢出結(jié)果來(lái)看，在MDR-TB病人中對(duì)異煙肼耐藥檢出率達(dá)97.0%（32∕33），而對(duì)利福平的耐藥檢出率則為93.9%（31∕33），同時(shí)其他四種抗結(jié)核藥的耐藥符合率也是相當(dāng)高的，所以通過(guò)不斷改進(jìn)和進(jìn)一步地完善該檢測(cè)技術(shù)是值得推薦做結(jié)核藥敏的好方法。

在進(jìn)行抗結(jié)核治療時(shí)，必須高度重視當(dāng)?shù)亟Y(jié)核菌的耐藥情況［17］。貴州是我國(guó)結(jié)核病高發(fā)病率、高耐藥率及高負(fù)擔(dān)地區(qū)之一［18］。由以上結(jié)果可以看出，本地區(qū)的結(jié)核病人耐藥情況仍然十分嚴(yán)重，而且對(duì)一線和二線的耐藥都呈現(xiàn)多重耐藥，所以進(jìn)行早期的耐藥結(jié)核病檢測(cè)并加以明確診斷、及時(shí)制訂有效的治療方案進(jìn)行治療，是治療成功的主要因素［19］。本研究的對(duì)象對(duì)二線抗結(jié)核藥耐藥較高的是Rft及PI，耐藥率依次為78.8%和33.3%，Rft耐藥率高的原因可能是利福霉素類(lèi)藥物具有交叉耐藥的特點(diǎn)。同時(shí)，本地區(qū)MDR-TB病人對(duì)左氧氟沙星、卷曲霉素、莫西沙星、克拉霉素、氯法齊明的耐藥率比較低，可以考慮根據(jù)病人實(shí)際情況聯(lián)合用藥的治療方案。

MDR-TB治療療程長(zhǎng)，通常需2～3年，且效果差，死亡率高［20］。除了加強(qiáng)病人規(guī)范治療和相關(guān)的結(jié)核病藥敏檢測(cè)外，力爭(zhēng)在新藥和新疫苗研制以及新診斷方法上取得突破［21］，就有可能破解MDR-TB病人治療難度或遏制結(jié)核病的發(fā)病率。近年來(lái)，將克拉維酸加入含有敏感的二線藥物方案中治療耐多藥∕廣泛耐藥肺結(jié)核，可提高痰涂片及痰培養(yǎng)的轉(zhuǎn)陰率，對(duì)MDR-TB或XDR-TB的治療效果較好，且羅美培南血腦屏障穿透率高，中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)發(fā)生低，在耐藥的TBM（耐多藥結(jié)核性腦膜炎）治療中具有一定優(yōu)勢(shì)［22］。

綜上所述，本地區(qū)MDR-TB病人多種耐藥較嚴(yán)重，MicroDSTTM法藥敏技術(shù)在本地區(qū)的推廣使用下，對(duì)MDR-TB病人的篩選和提供治療方案都有很大的幫助，當(dāng)然該技術(shù)也存在一些不足的地方，比如在本單位開(kāi)展的兩年多發(fā)現(xiàn)，對(duì)16種抗結(jié)核藥檢測(cè)中克拉霉素的藥敏檢測(cè)不夠穩(wěn)定，此外就是與羅氏藥敏“標(biāo)準(zhǔn)法”檢測(cè)的利福平與異煙肼依然存在一定的誤差，這還需要不斷改進(jìn)方能解決。