甲狀腺乳頭狀癌中緊密連接蛋白-1的表達與臨床意義

侯衛東，禹遠遠，李會敏，劉艷曉，劉艷鋒

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內分泌惡性腫瘤，發病率高。病理檢查依據形態學進行診斷，主要觀察分支復雜的乳頭狀結構和特征性細胞核改變。然而，在某些情況下可以觀察到病理形態的重疊，比如一些甲狀腺良性病變（benign thyroid lesions，BTL）亦可呈乳頭狀或假乳頭狀增生、少數濾泡亞型PTC與甲狀腺濾泡癌頗為相似，當細胞核的特征不典型時鑒別診斷常會存在一定困難。在這些病變中使用galectin-3、HBME-1（Hector Battifora mesothelial 1）和cytokeratin-19鑒別診斷價值有限［1］，也沒有達成免疫組化專家共識或指南，因此，有必要尋找其他免疫組化標志物作為輔助檢查手段。

細胞緊密連接不僅參與了細胞物質流動的調節，還具有細胞增殖、基因轉錄、腫瘤抑制和維持上皮細胞極性的功能［2-3］。甲狀腺單層濾泡上皮細胞的極性排列，以及濾泡腔與濾泡外之間的屏障作用都是由于緊密連接的存在［4］。截至目前，在人體組織中共發現27種緊密連接跨膜蛋白Claudin家族成員［5］，不同Claudin成員在不同腫瘤的表達各異。Claudin-1在細胞緊密連接中發揮著骨架蛋白的作用，被認為是負責上皮細胞屏障功能完整性最重要的蛋白質［2］，其異常表達與多種惡性腫瘤的生存期短有顯著相關性［6-7］，但在PTC組織中研究較少，并且混雜其他組織學類型的甲狀腺癌，國內鮮見報道。本研究擬通過免疫組化染色法探討PTC組織中Claudin-1的鑒別診斷價值，以及與PTC侵襲轉移能力的相關性，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究收集2017年1月至2019年10月平頂山市第一人民醫院和中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八九醫院平頂山醫療區甲狀腺手術存檔標本共計271例。其中PTC 116例，男女比例為1∶3.6；中位年齡47.5歲（年齡范圍18～69歲），＜55歲者占79.3%；腫瘤中位長徑5 mm（長徑范圍1～28 mm）。術后腫瘤分期參照AJCC第八版TNM分期進行。145例BTL病人中，男42例，女103例，男女比例為1∶2.5；中位年齡50.0歲（年齡范圍22～81歲），＜55歲者占71.7%。甲狀腺濾泡癌10例，男4例，女5例，男女比例為1∶2.5；中位年齡53.0歲（年齡范圍40～76歲），＜55歲者占50.0%。PTC組與BTL組、濾泡癌組病人性別（χ2=2.86，P=0.240）和年齡（χ2=5.10，P=0.078）分布差異無統計學意義。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，所有病人或其近親屬均簽署知情同意書。

1.2 方法所有標本經3.7%中性甲醛固定，常規石蠟切片，HE染色，光鏡下復核診斷。免疫組化染色采用pH 9.0的EDTA高溫高壓抗原修復法和EliVision-2染色法。免疫組化使用的一抗為Claudin-1（多克隆）。實驗操作步驟和結果判定參照試劑說明書進行。使用已知陽性對照片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照，對照片與研究標本在同一條件下進行染色。免疫組化使用的抗體和EliVision-2試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3 免疫組化結果判定Claudin-1陽性表達定位于細胞膜。評分標準參照Sinicrope 1995年首次應用的由Tanaka于2000年改良的定量記分法［8］，低倍鏡下觀察整張免疫組化染色切片，選取有代表性的不同區域進一步高倍放大，隨機觀察至少5個高倍視野（長徑550 μm），綜合判斷高倍鏡下染色強度評分和陽性細胞百分比評分。按染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分，百分比不同時取平均值。染色強度得分和陽性細胞百分比得分相乘，0分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），＞4分為（+++）；其中（-）和（+）為低表達，（++）和（+++）為高表達。

1.4 統計學方法應用SPSS 26.0統計軟件對實驗數據進行分析。分類數據采用率或百分數表示，并采用χ2檢驗（必要時連續性校正）或Fisher確切概率法進行比較，以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。按照臨床流行病學診斷試驗研究評價計算方法，計算Claudin-1診斷PTC的靈敏度和特異度。

2 結果

2.1 Claudin-1的表達Claudin-1在PTC、BTL與濾泡癌比較中均差異統計學意義（P＜0.001），見表1。此外，Claudin-1在腫瘤周圍的正常甲狀腺組織中全部不表達；在16例有PTC轉移的淋巴結中全部高表達（100%），并與甲狀腺內原發癌灶的表達一致。

表1 緊密連接蛋白-1（Claudin-1）在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）、甲狀腺良性病變（BTL）及濾泡癌中的表達

2.2 Claudin-1的表達與臨床病理參數的關系Claudin-1的高表達率在不同性別、年齡、癌結節長徑、癌結節數目、淋巴結轉移和TNM分期組間比較均差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 緊密連接蛋白-1（Claudin-1）的表達與甲狀腺乳頭狀癌（PTC）臨床病理參數的關系∕例（%）

2.3 Claudin-1表達的靈敏度和特異度評價Claudin-1診斷PTC的靈敏度為97.4%（113∕116），Claudin-1在PTC分別與BTL和濾泡癌的鑒別診斷中的特異度為88.3%（128∕145）和90.0%（9∕10）。

3 討論

本研究回顧性分析了271例甲狀腺良惡性病變組織中Claudin-1的表達情況，并分析了Claudin-1的表達與PTC侵襲轉移能力的相關性。我們發現Claudin-1在PTC組織中的表達與在BTL和甲狀腺濾泡癌中的表達差異有統計學意義；Claudin-1表達與PTC的淋巴結轉移和TNM分期等不相關。

在當前的研究中，Claudin-1在PTC中的高表達率（97.4%）顯著高于BTL（11.7%），在PTC分別與結節性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、濾泡性腺瘤和濾泡癌比較，仍表現差異有統計學意義（P＜0.001），呈現胞膜陽性表達模式。在所檢測病例的淋巴結轉移性PTC癌灶中全部高表達，并與同一病人甲狀腺內的原發癌灶表達一致。同時，研究表明正常甲狀腺濾泡上皮細胞不表達Claudin-1。

以往的多項研究也對各種甲狀腺病變中的Claudin-1進行過免疫組化染色評估。Nemeth等［9］通過定量評估的方法來測定甲狀腺腫瘤組織中Claudin-1陽性區域，結果顯示在PTC組織中腫瘤細胞胞膜強烈表達Claudin-1，而在甲狀腺濾泡性腺瘤和濾泡癌組織中表達微弱或陰性，單獨用Claudin-1區分PTC和濾泡性腫瘤有100%的特異度和70.3%的靈敏度。Abd El Atti等［10］研究發現Claudin-1可用于PTC和其他濾泡性結節的鑒別，與CD56（Claudin-1+∕CD56-）聯合后診斷PTC具有更高的特異度（100%）和敏感度（81.3%）。Tzelepi等［4］研究也發現Claudin-1在PTC中高表達（敏感度93%）。這些研究結果均與我們的研究結果相似。因此，Claudin-1免疫組化染色在區分PTC和BTL及濾泡癌方面具有重要參考價值，可作為PTC的診斷性標志物。高靈敏度和特異度使得Claudin-1在PTC轉移灶的判斷中又具有特殊意義，即在頸部淋巴結轉移癌中Claudin-1陰性應謹慎考慮PTC，需與甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）和甲狀腺球蛋白（Tg）聯合應用以確定是否為PTC轉移。需要指出的是文獻中Claudin-1表達率的不同可能在很大程度上受到截點值標準和一抗稀釋濃度的影響。

緊密連接Claudin-1是調節細胞間黏附的關鍵蛋白。Claudin-1表達的減弱或缺失可能導致細胞間黏附性喪失，造成細胞緊密連接功能失常和極性消失，可能會增加營養物質和其他生長生子向腫瘤細胞擴散，從而誘導腫瘤細胞惡性轉化、增殖和獲得轉移潛能［3，6，11］。相反，Claudin-1的過度表達能抑制癌細胞的分離，從而抑制腫瘤細胞遷移、入侵和轉移［3，12-17］。因此，目前認為Claudin蛋白是與腫瘤關系最為密切的緊密連接蛋白。雖然Claudin-1已經在多種惡性腫瘤中被研究，但其預后作用并未完全闡明。Pyo等［6］關于Claudin-1在各種惡性腫瘤中的預后作用的薈萃分析顯示，Claudin-1的低表達與乳腺癌、結直腸癌、食管癌、膽囊癌、頭頸部癌和肺癌的生存期短顯著相關，而與宮頸癌、肝癌或胃癌的生存期短無關。

另外，根據Pyo等［6］的研究結果，Claudin-1的低表達與甲狀腺癌的無病生存期短顯著相關。Tzelepi等［4］對Claudin在不同甲狀腺癌類型中的總體表達情況進行了深入研究，結果顯示Claudin-1在去分化的甲狀腺癌中表達減少，單變量分析顯示Claudin-1表達的減少或喪失與無病生存期短之間存在相關性。在本研究中顯示Claudin-1高表達幾乎發生在所有的PTC病例中，即使在PTC的淋巴結轉移灶內癌細胞仍然高表達Claudin-1，并且在形態學上癌細胞仍具有很強的黏附性（形成乳頭狀或腺管樣結構），這一發現進一步表明PTC中Claudin-1高表達可能具有抑制腫瘤細胞分離的作用。因此，高表達Claudin-1可能是PTC總體預后很好的重要因素之一。此外，Claudin-1高表達可作為PTC復發的重要預測指標［4，9］，以及潛在的藥物治療靶點［11-12，18-20］。

總之，在臨床實踐中檢測Claudin-1對不典型PTC病例的確診具有重要參考價值，并且具有高度的敏感性和特異性，可作為PTC與TBL和濾泡癌鑒別診斷的首選抗體，有助于提高正確診斷率。在判斷頸部淋巴結轉移性腫瘤的原發部位時，聯合檢測Claudin-1、Tg和TTF-1有 助 于 確 定 轉 移 性PTC。Claudin-1高表達可能是PTC總體預后很好的關鍵因素之一。