血漿細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子、環腺苷酸反應元件結合蛋白水平與糖尿病視網膜病變關系研究

胡紹波，李珊，鄒毅，孫文忠，張文君

糖尿病是中國常見慢性疾病，是世界范圍重大公共健康問題，發病率達11.6%，其發生可累及多個器官，其中，微血管是糖尿病主要累及器官之一［1］。當微血管產生病變累及視網膜時，會導致糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）發生。DR是最主要的致盲眼病，其致盲率較其他疾病高11倍，起病隱匿，出現后則難以遏制病程進展［2］。其發病主要與血管內皮損傷、凝血機制異常等有關，炎性因子、生長因子、細胞凋亡等多種分子及信號通路參與調控［3］。細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P15INK4b）在細胞周期調控中起關鍵作用，在干細胞分化、凋亡過程中起調控作用［4］。環腺苷酸反應元件結合蛋白（CREB）是核轉錄調節因子，與機體造血過程、細胞存活、增殖關系密切，對細胞凋亡有抑制作用［5］。目前，P15INK4b、CREB在DR發生發展中的作用尚未有人研究。本研究通過檢測P15INK4b、CREB在DR病人血漿中的表達水平，研究其與DR發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年6月至2019年6月在仙桃市第一人民醫院收治的糖尿病病人（觀察組）198例作為研究對象；根據是否患有DR，將糖尿病病人分為非DR組（95例）和DR組（103例）；根據病變階段將DR病人分為非增生性糖尿病視網膜病變（NPDR）Ⅰ期組（24例）、NPDRⅡ期組（29例）、NPDRⅢ期組（26例）和增生性糖尿病性視網膜病變（PDR）組（24例）；選取同期健康體檢者（對照組）200例作為對照。收集各組一般資料，包括：性別、年齡、體質量、體質量指數（BMI）。

納入標準：（1）糖尿病診斷符合2010年糖尿病治療指南［6］，DR診斷及分型符合《我國DR臨床診療指南（2014）年》［7］。（2）病人及近親屬知情并簽署知情同意書。（3）經仙桃市第一人民醫院倫理委員會審核批準（批號1704-3）。排除標準：（1）患有感染性疾病、免疫性疾病、精神疾病、心腦血管疾病、惡性腫瘤、肝腎功能異常者。（2）并發青光眼等其他眼部疾病者。（3）有中樞或外周神經疾病史、DR治療史病人。（4）妊娠或哺乳期婦女。（5）近期或正在服用影響血漿P15INK4b、CREB、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、血管內皮生長因子（VEGF）表達水平者。（6）依從性較差，未按規定進行檢查。（7）近1個月內參與過其他臨床試驗者。（8）資料不全者。

1.2 試劑與儀器所用蛋白質免疫印跡（Western blotting）檢測試劑盒（貨號ZD320）購自上海經科化學科技有限公司；所用人TNF-α、TGF-β1、VEGF酶聯免疫（ELISA）吸附法試劑盒（貨號分別為HL10038、HL10095、HL10094）均購自上海哈靈生物科技有限公司；酶標儀（型號MODEL550）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 樣本采集及指標檢測各組清晨采集空腹外周靜脈血2份，1份EDTA-K2抗凝，3 000 r∕min離心15 min，吸取血漿于1.5 mL EP管中，-20℃保存，用于P15INK4b、CREB水平檢測；1份4℃低溫3 000 r∕min離心10 min，吸取上層血清0.5 mL于無菌EP管中，用于TNF-α、TGF-β1、VEGF水平檢測。

Western blotting檢測血漿P15INK4b、CREB和ELISA法檢測血清TNF-α、TGF-β1、VEGF的試驗方法，均按照試劑盒說明書進行，P15INK4b、CREB蛋白相對表達量以P15INK4b、CREB蛋白條帶與內參照GADPH條帶灰度值比值表示。酶標儀測定吸光度值，波長為450 nm，重復3次，計算平均值，根據標準液吸光度結果與標準液濃度繪制標準曲線，得出換算方程，計算TNF-α、TGF-β1、VEGF表達水平。

1.4 統計學方法利用統計學軟件SPSS 24.0進行統計分析。計量資料均采用±s進行描述，四組行單因素方差分析，兩兩比較比較行LSD-t檢驗。計數資料均以例（%）表示，組間比較行χ2檢驗。Pearson法分析DR病人血漿P15INK4b、CREB水平與血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平的相關性。以糖尿病病人是否患DR作為因變量，將單因素方差分析有明顯差異的指標為自變量建立logistic回歸模型，Waldχ2檢驗回歸參數估計值，似然比檢驗模型擬合情況。當P＜0.05時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較兩組性別、年齡、體質量、BMI比較，均差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 糖尿病病人198例及健康體檢者200例一般資料比較

2.2 兩組血漿P15INK4b、CREB水平與對照組相比，觀察組血漿P15INK4b、CREB水平明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 糖尿病病人198例及健康體檢者200例血漿P15INK4b、CREB水平比較/±s

表2 糖尿病病人198例及健康體檢者200例血漿P15INK4b、CREB水平比較/±s

注：P15INK4b為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，CREB為環腺苷酸反應元件結合蛋白。

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2.3 兩組血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平與對照組相比，觀察組血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 糖尿病病人198例及健康體檢者200例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比較/±s

表3 糖尿病病人198例及健康體檢者200例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比較/±s

注：TNF-α腫瘤壞死因子-α，TGF-β1轉化生長因子β1，VEGF血管內皮生長因子。

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2.4 糖尿病各組血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平與非DR組相比，DR組血 漿P15INK4b、CREB、血 清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明顯升高（P＜0.05）。見表4。

表4 糖尿病病人198例血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比較∕±s

表4 糖尿病病人198例血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比較∕±s

注：P15INK4b為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，CREB為環腺苷酸反應元件結合蛋白，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，TGF-β1為轉化生長因子β1，VEGF為血管內皮生長因子。

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2.5 DR病人各組血漿P15INK4b、CREB水平與NPDRⅠ期組相比，NPDRⅡ期、NPDRⅢ期、PDR組DR病人血漿P15INK4b、CREB水平明顯升高（P＜0.05）；與NPDRⅡ期組相比，NPDRⅢ期、PDR組DR病人血漿P15INK4b、CREB水平明顯升高（P＜0.05）；與NPDRⅢ期組相比，PDR組DR病人血漿P15INK4b、CREB水平明顯升高（P＜0.05）。見表5。

表5 糖尿病視網膜病變（DR）103例血漿P15INK4b、CREB水平比較/±s

表5 糖尿病視網膜病變（DR）103例血漿P15INK4b、CREB水平比較/±s

注：P15INK4b為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，CREB為環腺苷酸反應元件結合蛋白，NPDR為非增生性糖尿病視網膜病變。①與NPDRⅠ期組相比，P＜0.05。②與NPDRⅡ期組相比，P＜0.05。③與NPDRⅢ期組相比，P＜0.05。

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2.6 DR病人各組血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平與NPDRⅠ期組相比，NPDRⅡ期、NPDRⅢ期、PDR組DR病人血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明顯升高（P＜0.05）；與NPDRⅡ期組相比，NPDRⅢ期、PDR組DR病人血清TNF-α、TGF-β1、VEGF表達水平明顯升高（P＜0.05）；與NPDRⅢ期組相比，PDR組DR病人血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明顯升高（P＜0.05）。見表6。

表6 糖尿病視網膜病變（DR）103例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比較/±s

表6 糖尿病視網膜病變（DR）103例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比較/±s

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，TGF-β1為轉化生長因子β1，VEGF為血管內皮生長因子，NPDR為非增生性糖尿病視網膜病變。①與NPDRⅠ期組相比，P＜0.05。②與NPDRⅡ期組相比，P＜0.05。③與NPDRⅢ期組相比，P＜0.05。

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2.7 DR病人血漿P15INK4b、CREB水平與血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平相關性相關性分析結果顯示，DR病人血漿P15INK4b、CREB水平與血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均明顯正相關（P＜0.05）。見表7。

表7 DR病人血漿P15INK4b、CREB水平與血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平的相關性分析

2.8 影響DR發生的多因素分析將糖尿病病人是否患DR作為因變量，以血漿P15INK4b、CREB水平、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平為自變量進行多因素logistic回歸分析，結果顯示血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均是影響DR發生的危險因素（P＜0.05）。見表8。

表8 影響DR發生的多因素分析

3 討論

如今，中國糖尿病患病人數高居全球第一，患病率達全球第二［8］。長期高血糖癥狀易引起并發癥，其中，DR是糖尿病病人常見微血管并發癥，是微動脈瘤形成、毛細血管灌注缺乏、視網膜局部缺血等原因，最終導致新生血管形成疾病［9］。研究表明，糖尿病病人病程為5～10年時，并發DR比率達50.0%～56.7%，在中國并發DR糖尿病病人占總糖尿病病人的37.2%～51.3%，當DR病人發病階段演變為PDR，即產生新生血管時，致盲率可高達23.6%，是50歲以上人群致盲主要原因，給糖尿病病人及家庭造成嚴重經濟負擔及精神壓力［10-11］。因此，研究DR發病及病情演變過程中的影響因素，對控制病人病情進展有重要意義。

P15INK4b常被當做腫瘤抑制因子，近年來被發現在糖尿病上也發揮作用。鐘凌等［12］研究表明，P15INK4b聯合miR-451a在糖尿病腎病的腎纖維化過程發揮作用，認為P15INK4b可通過調節細胞周期影響腎組織損害。CREB是一種基礎轉錄因子，活化后參與血管內皮細胞形成，誘導血管內皮細胞通透性增加，調控炎癥反應，在許多血管屏障破壞的疾病中發揮作用［13-15］。徐秀娟等［16］發現CREB參與大鼠的肺微血管內皮細胞的炎癥損傷過程。鄭轉珍等［17］發現CREB可通過參與機體的造血過程參與調控急性白血病的發生發展。P15INK4b、CREB分別與糖尿病、微血管內皮細胞調控有關，推測可能在糖尿病微血管并發癥上也發揮作用。

本研究結果表明，與對照組相比，觀察組血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明顯升高，提示P15INK4b、CREB、TNF-α、TGF-β1、VEGF參與糖尿病發生過程。與非DR組相比，DR組病人血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明顯升高，且隨著病變階段的升級，DR病人血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明顯升高；提示P15INK4b、CREB、TNFα、TGF-β1、VEGF參與調控DR的發生發展過程。DR病人血漿P15INK4b、CREB水平與血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均明顯正相關，提示P15INK4b、CREB可能通過調控血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平參與DR發生發展過程。血漿P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均是影響DR發生的危險因素，提示血漿P15INK4b、CREB、血清TNFα、TGF-β1、VEGF水平升高可能影響DR發生。

綜上所述，DR病人血漿P15INK4b、CREB水平上調，且隨著病情演變階段的升高而嚴重異常表達，可能通過調控血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平參與疾病的發生發展。但本研究存在不足，可進一步研究血漿P15INK4b、CREB的mRNA表達情況，及血漿P15INK4b、CREB水平對DR的診斷價值。