秋水仙堿誘導粗皮桉花粉染色體加倍研究

2022-01-04 02:23:52趙英偉康向陽

核農學報 2021年12期

劉釗熊濤趙英偉楊珺,* 康向陽

(1 北京林業大學林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2 北京林業大學林木、花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083；3 北京林業大學城鄉生態環境北京實驗室，北京 100083；4 北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；5 廣西壯族自治區國有東門林場，廣西扶綏 532199)

桉樹(Eucalyptusspp.)隸屬桃金娘科桉屬高大喬木，具有生長迅速、適應性強等特點[1]，是世界上最重要的人工商品林樹種之一，為工業生產提供了大量木材[2-3]，為制漿造紙提供了充足原料[4]。桉樹葉片含有的桉油還具有多種生物活性，是殺蟲劑、除草劑及各種藥品和化妝品中的重要有效成分[5-6]。作為世界上最重要的森林產品供應源，桉樹在超過200個國家和地區廣泛引種種植[7-8]。目前，全球范圍內桉樹人工商品林主要栽培使用的是雜交種[9]，但是近年來桉樹的遺傳改良遇到瓶頸，以雜交育種為主的良種選育已難以滿足日益增長的工業生產需求[10]。

多倍體育種是一種高效的林木遺傳改良途徑，已成功應用于許多重要闊葉樹種的良種選育工作[11-14]。有研究表明，三倍體林木在生長速度、木材材性[15-16]、次生代謝產物含量[17]、病蟲害抗性[18]等特性上相較二倍體具有顯著優勢。可以預見，開展桉樹多倍體新品種選育，對于提升桉樹木材產量和品質具有重大意義。目前，自然界中仍未發現天然多倍體桉樹的存在[19]，雖人工誘導體細胞染色體加倍獲得了四倍體桉樹[20-21]，但其在株高地徑生長上較二倍體并無優勢[22]。因此人工誘導桉樹配子染色體加倍，經授粉雜交獲得三倍體新種質是桉樹多倍體種質創新工作的重要途徑。

秋水仙堿是一種可以有效阻斷染色體分離的誘變劑，已成功應用于許多物種的染色體加倍研究工作[23-26]。但桉樹經秋水仙堿誘導花粉染色體加倍的相關研究極少，僅在尾葉桉上成功誘導獲得了少量未減數2n花粉，且誘導的有效率較低[27]。康向陽等[28]在楊樹花粉染色體加倍研究中證明，提高人工誘導花粉染色體加倍效率的關鍵在于準確預判和選擇對秋水仙堿敏感的小孢子母細胞減數分裂的特定時期，以及恰當的誘導處理強度。此結果為進一步開展人工誘導桉樹花粉染色體加倍研究提供了重要理論依據。

本研究以粗皮桉(EucalyptuspellitaF.V.Muell.)為對象，通過對花蕾發育以及小孢子母細胞減數分裂細胞學的特征與進程等進行觀察和分析，總結花蕾發育與小孢子母細胞減數分裂的時序性規律；通過對不同發育階段花蕾施加秋水仙堿處理誘導粗皮桉花粉染色體加倍，研究建立高效誘導桉樹未減數2n花粉技術體系，以期為進一步開展桉樹三倍體種質創新工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西壯族自治區國有東門林場雜交育種園內2015年定植的粗皮桉無性系為研究材料。該無性系共有20棵分株，經連續3年觀察，分株間長勢一致、花期穩定且花量較大，適宜開展花粉染色體加倍技術研究。

1.2 材料采集

在無性系中選定長勢和花枝發育較為一致的10棵分株作為研究材料，于2019年分別選取朝向一致向南、距地面高度相近、花蕾數量相對一致的若干花枝作為候選采樣花枝。根據候選花枝自主枝基部起向頂端的著生位置，采用阿拉伯數字順序對候選花枝進行編號；對每個花枝上不同著生位置的花序，自花枝基部起向頂端使用英文大寫字母順序依次編號(圖1)。如編號2-D表示自主枝基部向頂端的第2花枝上，自花枝基部起的第4個花序。

圖1 花蕾采樣編號Fig.1 Sampling number of flower bud

自進入花期起，持續監測候選花枝上花蕾發育與小孢子母細胞減數分裂情況。當首次觀察到目標花枝上有小孢子母細胞進入減數分裂細線期時，進行首次采樣并記為時間點0 h，此后每隔24 h進行花蕾采樣，直至采樣結束。使用游標卡尺測量待采花蕾直徑(測量3次取平均值)，然后立即將花蕾摘下放入預冷的卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中進行固定，并做好標記和數據記錄。所有采樣花蕾在4℃下固定24 h后更換至裝滿70%乙醇的離心管中完全浸泡，置于4℃冷藏貯存待用。

1.3 小孢子母細胞減數分裂的細胞學觀察

采用醋酸洋紅壓片法觀察粗皮桉小孢子母細胞減數分裂進程：固定好的花蕾沿蒴蓋脫落環位置進行環割，取下蒴蓋后挑取花絲頂端的花藥轉移至載玻片，滴加2%醋酸洋紅染液，鑷子夾碎花藥游離出小孢子母細胞，染色5 min后蓋好蓋玻片。使用BX51光學顯微鏡(日本Olympus公司)觀察記錄粗皮桉小孢子母細胞減數分裂各分裂相的特征及占比，并進行顯微拍照。

1.4 人工誘導粗皮桉花粉染色體加倍

于2020年開展秋水仙堿溶液處理花蕾誘導粗皮桉花粉染色體加倍工作，采用將秋水仙堿溶液導入花枝切口的方法對候選花枝上的目標花蕾進行處理[29]，誘導粗皮桉未減數2n花粉：在近花序位置，用刀具斜向切入花枝，造成深至木質部的切口。于切口處塞入棉線并用封口膜固定，棉線另一端置于離心管內，將離心管內0.5%濃度的秋水仙堿溶液導入切口花枝，經植物維管系統輸送至花藥內實現對小孢子母細胞的誘變處理，處理持續時長分別設置為3和6 h；誘變處理的同時設置不做處理的對照組，并做好標記。為統計未減數2n花粉的有效誘導率，散粉時采集若干處理組和對照組單花，經卡諾固定后對花粉進行醋酸洋紅制片觀察，以單花內未減數2n花粉占比超過1%為有效處理的標準，統計有效誘導率[30]。此外，為研究不同處理組別中小孢子母細胞處于減數分裂的具體時期，在進行秋水仙堿誘導處理的同時采集固定臨近花枝處于相同發育狀態的花蕾，留待細胞學觀察和統計分析。

1.5 數據分析

使用SPSS軟件處理試驗數據：采用一般線性模型分析不同著生位置花蕾的平均直徑差異[31]；差異顯著時采用最小顯著差數法(least significant difference,LSD)進行多重比較；有效誘導率與小孢子母細胞減數分裂各時期占比數據經平方根反正弦轉換后，計算皮爾森相關系數；使用Excel軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 粗皮桉長、短花絲雄蕊小孢子母細胞減數分裂觀察

根據采樣時間將花蕾樣本分為采樣組Ⅰ(48～96 h)、采樣組Ⅱ(144～196 h)和采樣組Ⅲ(240 h)共3組，對各組內單花依次進行醋酸洋紅壓片制片和顯微觀察，發現單一花蕾制片中存在多個不連續的小孢子母細胞減數分裂相。進一步觀察統計發現(表1)，粗皮桉單花內生有兩種類型雄蕊：長花絲雄蕊(長花絲向內卷曲、蒴蓋脫落前花藥緊貼花柱)和短花絲雄蕊(卷曲于長花絲內側)；各組別內單花內長雄蕊上小孢子母細胞減數分裂進程總是領先于短雄蕊。如當單花內長雄蕊上小孢子母細胞主要處于減數分裂細線期和粗線期時，短雄蕊上小孢子母細胞多數處于未進入減數分裂期的狀態(采樣組Ⅰ)；當長雄蕊上大部分小孢子母細胞發育至四分體和小孢子時期時，短雄蕊上小孢子母細胞仍以處于減數分裂中期Ⅰ-末期Ⅱ狀態為主(采樣組Ⅱ)。為便于統計各采樣時間點不同著生位置花蕾小孢子母細胞減數分裂的具體發育進程，后續研究統一以單花內長雄蕊上小孢子母細胞減數分裂所處的主要時期，認定為該花蕾的小孢子母細胞減數分裂時期，進行相關統計分析。

表1 粗皮桉花蕾內不同類型雄蕊小孢子母細胞減數分裂時期Table 1 Meiosis stage of microsporocytes among stamens of different types in the bud of Eucalyptus pellita

2.2 粗皮桉小孢子母細胞減數分裂細胞學特征與進程

根據采樣時間點和花蕾著生位置，依次對粗皮桉小孢子母細胞減數分裂進程進行連續觀察和統計。結果表明(附表S1)，粗皮桉小孢子母細胞自進入減數分裂細線期至發育為小孢子共歷時240 h。在0 h采樣樣本中，可以首次觀察到有少量花蕾小孢子母細胞開始進入減數分裂細線期(圖2-a)；隨后在24～72 h采樣樣本中，可以觀察到花蕾小孢子母細胞減數分裂終變期及以前各個分裂相，其中以前期Ⅰ為主，此階段染色體逐漸收縮變粗并最終聚縮成點狀或條狀(圖2-b，c,d)；在96 h采樣樣本中開始觀察到中期Ⅰ至末期Ⅰ等分裂相，此階段特點是胞內染色體開始從赤道板移向兩極并逐漸解螺旋(圖2-e,f,g)；此后，在144 h采樣樣本中小孢子母細胞處于第二次減數分裂期的占比逐漸增多，此時可觀察到平行或T形排列在赤道板附近的兩組染色體逐漸移至四極，核膜、核仁重新出現(圖2-h)；采樣至168 h時，小孢子母細胞發育至四分體和小孢子的花蕾已占多數，此時可清楚觀察到含4個子細胞的四分體細胞，以及游離出的正四面體形小孢子，在顯微鏡下投影平面為三角形(圖2-k,l)；至240 h采樣點，花蕾內僅能觀察到小孢子。

同一時間點采集的若干花蕾樣本所處的減數分裂時期存在差異，具體表現為同一花枝上不同著生位置花蕾的減數分裂進程不同步，處于形態學上端位置的花蕾減數分裂進程通常領先于形態學下端位置的花蕾(附表S1)。統計結果同時表明，D、E、F位置花蕾減數分裂進程相對一致。如在96 h采樣點，靠近花枝頂端在D、E、F位著生的花蕾小孢子母細胞減數分裂時期主要集中于雙線期至終變期；而此時著生于A、B、C位置的花蕾小孢子母細胞減數分裂則較不同步，分別處于小孢子母細胞、細線期至粗線期、雙線期至終變期等(附表S1)。這表明靠近花枝頂端D、E、F位置著生的花蕾，小孢子母細胞減數分裂進程通常領先并且同步性較好。

注：a:細線期；b:粗線期；c:雙線期；d:終變期；e:中期Ⅰ；f:后期Ⅰ；g:末期Ⅰ；h:中期Ⅱ；i.后期Ⅱ；j.末期Ⅱ；k.四分體；l.小孢子。Note:a:Leptotene.b:Pachytene.c:Diplotene.d:Diakinesis.e:Metaphase Ⅰ.f:Anaphase Ⅰ.g:Telophase Ⅰ.h:Metaphase Ⅱ.i:Anaphase Ⅱ.j:Telophase Ⅱ.k:Tetrad.l:Microspore.圖2 粗皮桉小孢子母細胞減數分裂進程(標尺=10 μm)Fig.2 Microsporogenesis in Eucalyptus pellita (Scale bar=10 μm)

2.3 粗皮桉不同位置花蕾直徑大小發育規律

各采樣時間點全部花蕾樣本的直徑測定結果表明(表2)，候選花枝上花蕾的直徑隨著花蕾發育時長增加而增大，并且花枝上不同著生位置花蕾的直徑大小改變有所不同。自0 h采樣開始至240 h采樣結束，A位置花蕾平均直徑增加最少，為0.28 mm，E、F位置花蕾平均直徑增加均超過0.40 mm。同一時間點，花枝上不同著生位置花蕾的直徑大小亦有所不同，方差分析結果顯示，除0 h采樣時間點外，其他采樣時間點不同著生位置花蕾直徑大小存在顯著差異，處于形態學上端的花蕾平均直徑大于形態學下端的花蕾，240 h采樣點時，F位置比A位置花蕾平均直徑大0.89 mm。多重比較結果顯示，靠近花枝頂端的C至F位置著生的花蕾間直徑無顯著差異，但多與A、B位置著生花蕾直徑大小存在顯著差異。該結果從花蕾直徑發育方面再次驗證了位于花枝頂端位置著生的花蕾發育更加領先且一致性相對較高。

表2 花枝不同位置各采樣時間花蕾直徑發育Table 2 Flower buds diameter development at different positions at each sampling time /mm

2.4 秋水仙堿溶液處理誘導粗皮桉未減數2n花粉

根據開展誘變處理時間點和處理時長的不同，各目標花枝被分為若干處理組別，累計誘導處理花蕾2 758個。各處理組花蕾于散粉期進行細胞學觀察用于確定誘變處理效果，結果顯示，一些處理組別的花蕾內小孢子母細胞減數分裂發生改變，可在顯微鏡下觀察到二分體以及大花粉出現(圖3)，證實了秋水仙堿誘導未減數2n花粉的有效性；對照組花蕾中未發現二分體或大花粉，僅可見含有4個子細胞的正常四分體細胞。處理組觀察到的二分體僅含2個子細胞，每個子細胞相較四分體子細胞更大，直徑差異顯著(t=17.77，P<0.01)。對照組小孢子為正四面體型，顯微鏡下投影平面呈三角形，可見明顯萌發孔，平均直徑為19.10 μm；而秋水仙堿處理后誘導獲得的未減數2n花粉為球形，顯微鏡下投影平面為圓形，萌發孔不再清晰可辨，平均直徑為24.71 μm，顯著高于對照組普通單倍性花粉(t=19.49，P<0.01)。

自目標花枝上首次觀察到有花蕾進入小孢子母細胞減數分裂細線期為起始，至240 h后減數分裂基本完成，期間以24 h為間隔劃分為10個處理時間點，每個處理時間點分別設置3和6 h兩種處理時長。各處理時間點和不同時長誘變處理的結果統計表明(表3)，經秋水仙堿處理后，各處理組花蕾數量均減少；未減數2n花粉的有效誘導率，受到處理時間點和處理時長的共同影響。在0和168 h及之后的時間點進行秋水仙堿處理均未獲得2n花粉；而24～144 h進行秋水仙堿溶液處理，未減數2n花粉的有效誘導率先上升后下降，其中48 h時間點進行6 h處理時長的處理組未減數2n花粉有效誘導率最高，達到31.34%；成功誘導獲得未減數2n花粉的處理組中，同一處理時間點，處理6 h的有效誘導率顯著高于處理3 h(t=2.62，P<0.05)。

注：a:正常四分體；b:二分體；c:正?；ǚ?；d:2n大花粉。Note:a:Normal tetrad.b:Dyad.c:Normal pollen.d:2n pollen.圖3 粗皮桉小孢子母細胞減數分裂進程(標尺=10 μm)Fig.3 Microsporogenesis in Eucalyptus pellita (Scale bar=10 μm)

2.5 誘導粗皮桉2n花粉的最佳處理時機

實施秋水仙堿處理的同時，采集部分候選花枝靠近頂端著生的與處理組發育狀態相同的若干花蕾，用于明確該處理試驗點處理組花蕾所處的準確減數分裂時期，以探究誘導粗皮桉未減數2n花粉的最佳處理時機。統計結果顯示(表4)，盡管采樣觀察對象為候選花枝頂端發育較為一致的花蕾，但各處理時間點除占比最高的主要減數分裂時期外，也存在多個相鄰的減數分裂時期；隨時間推移，不同處理時間點的花蕾小孢子母細胞減數分裂發生時期比例不斷變化。如在48 h處理時間點，以小孢子母細胞減數分裂處于細線期至粗線期的花蕾為主，占比達到61.00%，遠高于其他時期的花蕾數量。

基于每個處理時間點采集的樣本花蕾所處減數分裂時期(表4)，以及各處理組未減數2n花粉有效誘導率(表3)，采用皮爾森相關分析確定秋水仙堿處理誘導未減數2n花粉產生的最佳處理時機。結果顯示(圖4)，目標花枝上小孢子母細胞減數分裂處于細線期至粗線期的粗皮桉花蕾占比，與未減數2n花粉有效誘導率之間呈顯著正相關(r=0.937，P<0.01)；各處理組中，未減數2n花粉的有效誘導率隨著處理對象中處于小孢子母細胞減數分裂細線期至粗線期的花蕾占比的增加而提高，在48 h處理時間點時，細線期至粗線期花蕾占比達到61.00%，此時2n花粉的有效誘導率最高，達到31.34%。這表明花蕾內小孢子母細胞發育至減數分裂細線期至粗線期時，是開展秋水仙堿處理誘導粗皮桉未減數2n花粉的最佳處理時機。

表3 秋水仙堿溶液處理誘導粗皮桉花粉染色體加倍的有效誘導率Table 3 Effective induction rate of pollen chromosome doubling treated with colchicine solution in Eucalyptus pellita

表4 粗皮桉花蕾發育時間與小孢子母細胞減數分裂時期對應關系Table 4 Relationship between development time and meiosis period of microsporocytes in Eucalyptus pellita

注：縱坐標為0.5%秋水仙堿溶液處理6 h后2n花粉有效誘導率，橫坐標為對應時間小孢子母細胞減數分裂時期花蕾比例。Note:The ordinate is the effective induction rate of 2n pollens after 6 h treatment with 0.5% colchicine solution,and the abscissa is the proportion of flower buds in meiosis stages of microsporocytes at corresponding time.圖4 2n花粉有效誘導率與小孢子母細胞減數分裂時期相關關系Fig.4 Correlation between effective pollen induction rate and meiosis stage of microsporocytes

3 討論

研究小孢子母細胞減數分裂特征與進程是開展人工誘導未減數2n花粉的先決條件，原因在于物理或化學方法誘變產生2n花粉的原理，是在植物細胞減數分裂的特定敏感時期施加特定的誘變方法阻滯染色體的分離[28]。本研究中，粗皮桉花蕾內存在長花絲和短花絲兩種雄蕊類型，兩者間小孢子母細胞減數分裂進程存在明顯差異，這種小孢子母細胞減數分裂的不同步性問題在多個樹種中均有報道[32]。在桉樹上，Davis[33]最早報道了密味桉(EucalyptusmelliodoraA.Cunn.)花蕾內部存在兩種不同長度的雄蕊，即長花絲雄蕊和短花絲雄蕊。Yang等[31,34]曾分別對兩種雜交桉花蕾發育進行觀察研究，認為其花蕾內長花絲雄蕊小孢子母細胞減數分裂進程領先于短花絲雄蕊，與本研究的發現一致。這種小孢子母細胞減數分裂不同步的現象，被認為是植物適應環境的結果[35]，但也給染色體誘變育種工作中配子細胞減數分裂時期判別造成了影響。針對這種情況，本研究統一選擇以花蕾內發育進度較為領先的長花絲雄蕊小孢子母細胞所處的減數分裂時期，判定為此刻該花蕾減數分裂的具體時期。

對花蕾發育研究發現，同一粗皮桉花枝不同著生位置的花蕾發育同樣存在不同步性。這種花發育的不同步性并不罕見，在楊樹[12]、杜仲[36]、橡膠[37]等樹種的花粉發育研究中均有報道。在桉樹上，有研究發現尾細桉雜種(Eucalyptusurophylla×E.tereticornis)位于花枝基部花蕾的直徑發育和減數分裂進程均領先于枝條上部的花蕾，而尾巨桉雜種(Eucalyptusurophylla×E.grandis)則相反[31,34]。本研究中粗皮桉的花蕾發育模式與尾巨桉類似?；ɡ侔l育的不同步性可能與花芽分化早晚及花蕾發育的成熟度有關。這種現象可以延長散粉期，對于桉樹后代繁殖具有重要意義[35,38]，但同樣給本研究中根據花蕾發育進程確定誘變對象造成了影響。本研究發現盡管總體上粗皮桉花枝不同位置著生花蕾的發育存在差異，但可以利用花枝上靠近頂端著生的D、E、F位置花蕾直徑發育與減數分裂進程相對一致的特性，針對性地剔除難以辨別發育進程的花蕾，從而保留一致性較高、可以準確判定發育狀態的目標花蕾，甄選誘變處理的對象。

基于以上結論，選擇不同處理時間點開展秋水仙堿誘變處理，并在一些組中成功獲得了粗皮桉未減數2n花粉。與單倍性花粉相比，誘導獲得的2n花粉呈球形，直徑較單倍性花粉顯著增大。原因在于花粉的大小通常與其倍性水平總體呈正相關關系[39-42]。此外，已有研究證實桉樹小孢子母細胞減數分裂僅發生一次胞質分裂，完成后產生四分體[31,34]。本研究在成功誘導獲得2n花粉的處理組中，觀察到大量二分體，表明秋水仙堿成功阻滯了細胞染色體的遷移。粗皮桉減數分裂后二分體的出現，以及形態、大小顯著改變的2n大花粉的出現，是通過細胞學觀察驗證花粉染色體加倍結果的重要依據。

秋水仙堿處理誘導未減數2n配子，關鍵在于誘變時機和誘變強度的選擇[26,28]。本研究發現對花蕾施加秋水仙堿處理的時機和時長不同，都會影響2n花粉的有效誘導率。在處理時機的選擇上，本研究發現，在觀察到小孢子母細胞進入減數分裂48 h后，即處于細線期至粗線期的花蕾占比最高時，施加誘變處理的有效誘導率最高，達到31.34%。這表明粗皮桉小孢子母細胞減數分裂細線期至粗線期是開展秋水仙堿溶液處理誘導未減數2n花粉的最佳處理時機。處理時機的選擇與楊樹[28，43]、杜仲[37]等樹種的相關研究結果一致。但粗皮桉的2n花粉有效誘導率明顯低于杜仲和楊樹(約為49.5%～80.0%)。其原因在于桉樹花蕾發育的一致性明顯低于杜仲和楊樹，使得一組有效的誘變處理無法確保目標花蕾內所有小孢子母細胞全部處于最佳處理時期。這種減數分裂高度不同步的特性是制約桉樹配子染色體加倍誘導效率的關鍵。

除合適的處理時機外，不同的處理時長也會影響誘變處理的效果。本研究中，3和6 h時長的處理組均可獲得未減數2n花粉，6 h處理組的有效誘導率更高。原因在于目標花蕾內小孢子母細胞的減數分裂進程是不同步的，并在誘變處理的同時持續進行，誘變處理時間的延長，可使一次誘變處理覆蓋更多目標時期，從而提高有效誘導率。楊樹采用多次注射秋水仙堿的方法延長處理時長以提高有效誘導率[25]。但多次注射的方法可能對花蕾造成更多的機械損傷，從而影響花粉產量[28]。本研究采用花枝一次性切口引入秋水仙堿的處理方式，可在增加處理時長的同時有效避免對花蕾造成機械傷害，有助于獲得更多的誘變花粉。此外也要注意，秋水仙堿對植物細胞有一定毒害作用，處理時長應控制在一定范圍內以降低對花蕾的傷害[44]。

4 結論

人工誘導未減數2n花粉是創制植物多倍體新品種的重要途徑之一。本研究揭示了粗皮桉花蕾發育與小孢子母細胞減數分裂的時序性關系，建立了基于花蕾著生位置和發育時數，即時判別粗皮桉小孢子母細胞減數分裂時期的方法。即以花蕾內長花絲雄蕊小孢子母細胞減數分裂進入細線期開始，根據花蕾發育時長與小孢子母細胞減數分裂時序關系判斷花蕾所處的具體減數分裂時期。同時，本研究明確了采用秋水仙堿溶液處理誘導粗皮桉花粉染色體加倍的最佳時機和最佳處理強度。待觀察到小孢子母細胞減數分裂開始后48 h，即多數花蕾處于細線期至粗線期時，在靠近花序位置的花枝上切口并導入0.5%濃度秋水仙堿溶液，處理花蕾6 h效果最佳。本研究結果為進一步開展桉樹多倍體種質創新工作提供了理論論據。