外周血循環腫瘤細胞與不同片段長度cf DNA診斷乳腺癌臨床價值研究

雪來提·派祖拉，艾司克爾·阿尤甫，伊麗娜，許文婷，張晨光，蔣威華，歐江華

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 乳腺外科二病區，新疆 烏魯木齊 830000

乳腺癌是一類起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其發病率高居女性惡性腫瘤首位[1]。目前，乳腺癌的常規篩查多借助X線、超聲等影像學手段，但在早期乳腺癌檢出敏感性和準確性方面均無法滿足臨床需要[2]。外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)代表人體外周血腫瘤細胞，主要來源于原發病灶或轉移瘤，并能夠作為腫瘤細胞侵襲轉移的重要預測指標[3]。cf DNA是指循環血中細胞外游離的片段化DNA，已被用于多種腫瘤的輔助診斷[4]。有研究證實，CTCs和cf DNA均可用于惡性腫瘤的輔助診斷及預后評估[5]。本研究旨在探討外周血CTCs與不同片段長度cf DNA診斷乳腺癌的臨床價值。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 將新疆醫科大學附屬腫瘤醫院自2019年1月至2021年1月收治的42例乳腺癌患者納入惡性組，將同期收治的60例乳腺良性疾病患者納入良性組，將同期60例健康體檢者納入健康組。惡性組和良性組納入標準：經影像學及病理組織學檢查確診為乳腺癌或乳腺良性疾病；年齡18～75歲；于我院完成CTCs和cf DNA檢測。排除標準：合并其他系統惡性腫瘤；合并免疫或血液系統疾病；妊娠或哺乳期女性。惡性組年齡31～73歲，平均年齡(53.60±9.24)歲；腫瘤最大徑<5 cm 30例，腫瘤最大徑≥5 cm 12例；TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例；合并淋巴結轉移22例。良性組年齡33～75歲，平均年齡(52.90±9.67)歲；乳腺小葉增生27例，乳腺囊腫18例，乳腺纖維腺瘤8例，乳腺炎7例。健康組年齡30～74歲，平均年齡(51.86±9.10)歲。3組研究對象年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究對象均簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法及觀察指標 比較3組的外周血CTCs陽性率、cf DNA水平，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評估外周血CTCs、cf DNA單用及聯合檢測對乳腺癌的診斷效能。采集3組研究對象晨起空腹血液4～5 ml，采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)法完成DNA提取，試劑盒由Invitrogen提供，采用定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)完成外周血cf DNA檢測。采用qPCR檢測cf DNA中241 bp和100 bp片段表達量，內參采用β-actin，計算241 bp/100 bp hTERT以評價血漿cf DNA完整性。外周血CTCs檢測采用Veridex公司Cell Search檢測系統，采集7.5 ml血漿與6.5 ml緩沖液混合后3 000 r/min離心10 min，吸取上清檢測。CTCs陽性標準：每7.5 ml外周血中檢出≥1.0個CTCs[6]。

2 結果

2.1 3組外周血CTCs陽性率比較 惡性組、良性組、健康組的外周血CTCs陽性率分別為38.1%(16/42)、16.7%(10/60)、13.3%(8/60)，惡性組外周血CTCs陽性率高于良性組、健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 3組外周血cf DNA水平比較 惡性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于良性組，良性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組外周血cf DNA水平比較

2.3 外周血cf DNA對乳腺癌預測價值 100 bp hTERT預測乳腺癌的ROC曲線下面積最小，為0.873(0.766～0.980)，臨界值為31.25 ng/ml；241 bp hTERT預測乳腺癌的ROC曲線下面積為0.908(0.825～0.991)，臨界值為7.36 ng/ml；241 bp/100 bp hTERT預測乳腺癌的ROC曲線下面積最大，為0.919(0.833～0.998)，臨界值為0.22 ng/ml。見圖1。

圖1 外周血cf DNA對乳腺癌預測價值ROC曲線

2.4 外周血CTCs、cf DNA單用及聯合檢測對乳腺癌診斷效能 以ROC曲線臨界值作為外周血cf DNA的陽性判定標準，CTCs聯合100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT診斷乳腺癌的效能最高，靈敏度、特異度、準確度分別達95.24%、91.67%、93.14%。見表2。

表2 外周血CTCs、cf DNA單用及聯合檢測對乳腺癌診斷效能

3 討論

乳腺癌現已成為導致女性死亡的主要惡性腫瘤類型，乳腺癌根治術聯合術后輔助治療作為首選方法在延長患者生存時間和降低復發風險方面顯示出良好獲益[7-8]，但仍有部分晚期患者無法完成手術切除，預后較差[9]。乳腺癌的早期篩查以影像學檢查為主，同時輔以部分血清學指標，但整體檢出準確率較低，存在局限性[10-11]。因此，尋找敏感的特異標志物以實現乳腺癌早期準確檢出已成為醫學界關注的熱點問題。

CTCs是外周血中檢測出的一組異質腫瘤細胞，主要來源于原發、復發或轉移病灶脫落細胞[12]。有研究報道，CTCs與惡性腫瘤轉移關系密切，并可用于惡性腫瘤的輔助診斷及預后評估[13-14]。本研究中：惡性組外周血CTCs陽性率高于良性組、健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。這證實，外周血CTCs與乳腺癌的發生發展密切相關，其陽性常預示腫瘤細胞已經由原發、復發或轉移病灶轉移至外周血。cf DNA屬于游離核酸，其來源包括壞死、凋亡的腫瘤細胞及腫瘤細胞自身合成分泌，近年來被廣泛應用于惡性腫瘤的輔助診斷[15]。本研究通過檢測100 bp和241 bp hTERT目的基因來評價血漿cf DNA的含量及完整性，結果顯示：惡性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于良性組，良性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。即乳腺癌患者外周血cf DNA含量和完整性均較乳腺良性疾病患者和健康人群更高，間接支持了cf DNA含量和完整性與乳腺癌發生發展的潛在關系。有研究發現，腫瘤細胞凋亡、壞死及轉移過程中均可能將大量游離DNA片段釋放至外周血，同時，惡性腫瘤患者外周血DNA酶抑制劑水平往往較高，而這一狀態能夠抑制游離DNA降解，導致cf DNA水平和完整性提高[16-17]。

本研究ROC曲線分析結果顯示：100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT預測乳腺癌的ROC曲線下面積分別為0.873(0.766～0.980)、0.908(0.825～0.991)、0.919(0.833～0.998)。即100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT對乳腺癌具有一定的預測價值。ROC曲線分析結果還顯示：100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT預測乳腺癌的ROC曲線臨界值分別為31.25 ng/ml、7.36 ng/ml、0.22 ng/ml，以臨界值作為外周血cf DNA的陽性判定標準，CTCs聯合100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT診斷乳腺癌的效能最高，高于CTCs、100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT、CTCs聯合100 bp hTERT、CTCs聯合241 bp hTERT、CTCs聯合241 bp/100 bp hTERT，靈敏度、特異度、準確度分別高達95.24%、91.67%、93.14%。分析其原因：外周血CTCs水平與乳腺癌轉移關系更為密切，轉移性乳腺癌CTCs陽性比例相對較高[18]，而本研究納入的轉移性乳腺癌患者較少，影響了CTCs對于乳腺癌的診斷價值。因此，臨床乳腺癌篩查中應優先選擇外周血cf DNA檢測。

綜上所述，外周血CTCs聯合不同片段長度cf DNA對于乳腺癌具有較高的診斷效能。本研究存在一定不足：納入樣本量較少，且為單中心回顧性研究，結論無法排除偏倚因素影響，有待后續更大規模、更為嚴謹的研究論證。