中毒顆粒人工鏡檢定量方法的建立及臨床應用

張文萍， 張仲明， 羅燕婷， 楊燕梅， 余志勇， 曲久鑫

[深圳市第三人民醫院（南方科技大學附屬第二醫院）檢驗科，廣東 深圳 518114]

細菌性感染是臨床常見的感染性疾病之一，嚴重細菌性感染導致的膿毒癥是導致患者死亡的重要原因之一[1]。不同性質的感染臨床治療方法不同，故臨床實驗室快速鑒別病原菌意義重大[2]。目前，臨床對細菌性感染的確診主要根據微生物培養結果，但該法陽性率和準確性受標本采集等因素影響較大，且耗時長，一般需3～4 d，無法滿足急診危重患者的救治需求[3]。因此，臨床實驗室迫切需要尋找成本較低，能準確診斷感染程度的指標。

有研究結果表明，中毒顆粒、空泡、杜勒小體等中性粒細胞形態改變對診斷急性細菌感染有較大價值[3-4]，聯合中性粒細胞絕對值、桿狀核粒細胞比例可提高診斷細菌感染性疾病的敏感性[5]。雖然顯微鏡下中性粒細胞形態改變（中毒顆粒、空泡、杜勒小體）一直是判斷患者細菌感染程度的參考，但因無統一識別標準，且檢測結果受檢測人員主觀因素和染色因素影響，難以標準化[6-8]，大多數臨床實驗室未常規開展，只有在鏡檢發現嚴重中毒顆粒存在時，才作為細菌感染的佐證告知臨床，而臨床醫生在進行疾病診療時往往希望有更多證據提示患者感狀情況，尤其是能在疾病發展早期給出標準的量化提示。本研究擬建立定量檢測外周血中性粒細胞中毒顆粒的方法，以指導臨床實驗室對患者外周血中的中毒顆粒進行準確的定量識別，明確染色因素對中毒顆粒鏡下識別結果的影響，以及中毒顆粒在鑒別細菌性感染中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機選取深圳市第三人民醫院感染科、呼吸內科等診斷明確的62例細菌感染患者（感染組），其中男36例、女26例，年齡18～87歲；以同期50名體檢健康者作為正常對照組，其中男21名、女29名，年齡24～64歲。

1.2 方法

參考相關文獻[9-11]，結合不同臨床實驗室對中毒顆粒識別的方法，建立中毒顆粒鏡下人工定量方法。（1）中毒顆粒與疾病的關系。收集所有研究對象就診時的乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本，為消除制片和染色過程中操作誤差的干擾，統一使用SC-120全自動推染片機（深圳邁瑞公司），在默認染色[瑞氏-吉姆薩染液（珠海Baso公司）]條件下制備標準化外周血涂片（每例樣本制備2張血涂片），由2名有豐富閱片經驗的技師對血涂片進行鏡檢，計數100個中性粒細胞，并根據制定的規則對每個中性粒細胞中毒顆粒程度進行分級，計算中毒顆粒定量參數；（2）染色條件的影響。隨機挑選3例感染科患者樣本和2例體檢者樣本，每例樣本用推染片機制備10張不同染色條件的血涂片（表1），分為5組，每組2張，由2名經驗豐富的檢驗人員對血涂片進行鏡檢；按照制定的規則計算各組血涂片中毒顆粒定量結果；以正常染色條件（C組）下的結果作為參考值，其他染色條件（A、B、D、E組，表1）下的結果作為實驗組結果，計算實驗組中毒顆粒鏡檢結果與參考值的偏差，然后以樣本編號作為橫坐標，以不同染色條件下的結果的偏差作為縱坐標繪制結果偏差圖。

表1 染色時間與染色比例選擇及血涂片染色數量

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.4.3軟件進行統計分析。呈非正態分布的計量資料采用中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估中毒指數和中毒積分診斷細菌感染性疾病的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中毒顆粒鏡檢定量方法

中毒顆粒鏡檢定量方法以中毒指數和/或中毒積分表示。（1）油鏡下計數100個中性粒細胞，計算中毒指數，計算公式為：中毒指數=含中毒顆粒的中性粒細胞/[所有計數的中性粒細胞數（通常為100或200個）]×100%。（2）計數100個中性粒細胞，并按分級方法（表2、圖1）對每個中性粒細胞中毒顆粒情況進行計分，計算中毒積分（100個中性粒細胞的積分總和），計算公式為：中毒積分=∑（Ni×Si）/∑Ni×100，式中i表示含中毒顆粒的中性粒細胞的等級（分別為0、1、2、3、4級），N表示每個等級中性粒細胞的數量，S表示每個等級所對應的中毒積分（分別為0、1、2、3、4分）。

表2 單個中性粒細胞中毒顆粒分級標準

圖1 各級含中毒顆粒中性粒細胞顯微鏡下形態

2.2 不同染色條件下中性粒細胞中毒顆粒著色情況及定量結果比較

不同染色條件下中性粒細胞中毒顆粒著色情況見圖2，中毒指數和中毒積分與參考值結果的絕對偏差見圖3。其中樣本3和5為對照組，樣本1、2、4為感染組；A組樣本中毒顆粒定量結果顯著低于C組（參考值），提示中毒顆粒未完全著色，導致人工鏡下識別假陰性；B組中毒顆粒定量結果偏差不一，提示該染色條件下中毒顆粒著色不一，導致人工識別存在較大主觀誤差；D、E組樣本中毒顆粒定量結果顯著高于C組（參考值），提示中毒顆粒著色過深，導致人工鏡下識別假陽性。

圖2 不同染色條件下中性粒細胞中毒顆粒著色情況

圖3 不同染色條件下中毒指數和中毒積分定量結果偏差圖

2.3 細菌感染組與正常對照組中毒指數、中毒積分比較

細菌感染組中毒指數為48.7（22.2～84.5）%中毒積分為58.0（12.0～131.1）分，均顯著高于正常對照組[2.0（1.0～5.0）%、2（1～5）分]（Z值分別為-8.64、-3.46，P＜0.000 1。

2.4 中毒指數與中毒積分診斷細菌感染的效能

ROC曲線分析結果顯示，中毒指數和中毒積分診斷細菌感染的曲線下面積（95%可信區間）分別為0.921（0.862～0.980）和0.900（0.838～0.963），最佳臨界值分別為6%、6分，敏感性分別為88.7%和83.9%，特異性分別為86.0%和86.0%。見圖4。

圖4 中毒指數與中毒積分診斷細菌感染性疾病的ROC曲線

2.5 中毒指數與中毒積分的關系

相關性分析結果顯示，中毒指數和中毒積分呈正相關（r2=0.89），在正常對照者或輕度感染患者中，2個指標結果一致性較好，但中毒顆粒分級較高時，中毒積分較中毒指數有更寬的檢測范圍。見圖5。

圖5 中毒指數與中毒積分的相關性

3 討論

中毒顆粒是中性粒細胞細胞質中比正常中性顆粒粗大、大小不等、呈黑色或紫黑色的顆粒[9]，實際上是特殊中性粒細胞嗜苯胺藍顆粒，其在早幼粒細胞階段形成，并在中性粒細胞中成熟，含有效抗菌成分[10-11]。當發生嚴重細菌感染時，粒細胞集落刺激因子被激活，大量未成熟粒細胞被釋放入外周血，嗜苯胺藍顆粒中的酸性黏液物質不斷增多，最終形成中性粒細胞中毒顆粒，中毒顆粒在pH值為5.5～7.3時能有效增強滅菌活性[10-11]。當患者被細菌感染時，中毒顆粒是中性粒細胞形態改變的特征之一，通過觀察中性粒細胞中毒顆粒程度，對細菌感染有較好的提示作用[10-11]。

人工鏡檢是目前中毒顆粒唯一的檢測方法，能直觀地捕捉到細胞被攻擊的情況和人體抵抗的狀態。但在樣本量巨大、檢驗項目眾多的臨床實驗室，采用傳統的人工鏡檢方法檢測中毒顆粒存在一定困難，對檢測人員要求較高，且中毒顆粒易與嗜堿性顆?；煜?，中毒顆粒量化無統一識別標準，不同檢測人員主觀判斷不一致，因此限制了該項目的廣泛應用[5]。

有學者建議以中毒指數對中毒顆粒進行定量，但該方法只有中毒顆粒中性粒細胞比例，未對單個中性粒細胞中毒顆粒程度進行準確分級[12-13]。有研究發現，在中毒指數＞80%的區域內，中毒指數上升趨勢明顯下降，不能很好地反映中毒顆粒數量與大小，而中毒積分相對于中毒指數在整個區域內均有良好的上升趨勢，有更寬的檢測范圍，在中毒顆粒較多的情況下，可更準確地反映中毒顆粒數量。本研究建立的分級和積分計算方法根據中毒顆粒大小、數量和密度進行分級，并給出對應參考圖示，可更好地幫助檢測人員進行中毒顆粒分級和積分計算，與臨床實驗室開展中性粒細胞堿性磷酸酶染色定量方法類似，實驗室工作人員更易接受。

本研究結果表明，中毒顆粒定量結果與血涂片染色質量關系較大，在染色偏堿或染色時間過長時，正常中性粒細胞的顆粒會著色加深，導致中毒顆粒假陽性；在染色偏酸或染色時間不足時，中毒顆粒著色偏淺，可能無法被準確地識別，導致假陰性結果。因此，建議臨床實驗室使用固定染色條件下的推染片機統一制備標準的外周血涂片，然后再進行中毒顆粒的人工鏡檢，以消除人工操作帶來的誤差。本研究使用的全自動推染片機，其默認染液和緩沖液的比例是2∶18，染色時間為瑞氏-吉姆薩染液A液染色1 min，A和B混合液染色4 min，具有良好的染色效果。有學者發現，全自動推染片機在默認染色條件下制備的標準血涂片優于傳統手工涂片染色[13-15]，故以正常染色情況（C組）下的結果作為參考值，本研究結果可供其他臨床實驗室參考。

相關研究結果已證實細菌感染性疾病與中毒顆粒有關[13-15]。本研究結果顯示，細菌感染組中毒指數和中毒積分分別為48.7（22.2～84.5）%和58.0（12.0～131.1）分，均顯著高于正常對照組[2.0（1.0～5.0）%和2（1～5）分，P＜0.000 1]；此外，中毒指數和中毒積分診斷細菌感染性疾病的曲線下面積分別為0.921和0.900，提示本研究所建立的中毒顆粒人工鏡檢定量方法能有效反映患者細菌感染的情況，完全可以作為指示患者細菌感染的良好指標。由于人工鏡檢的工作量較大，本研究并未將病毒感染患者、膿毒癥患者納入統計，后續的研究將納入此類病例樣本，分析中毒顆粒在細菌和病毒感染的鑒別診斷、細菌感染和膿毒癥的鑒別診斷中的價值。