EPO-CS/GP/GA水凝膠促進骨髓間充質細胞成骨分化的研究

趙 亮，林曉鷺，陳宏柏，盧奕達 (.廈門醫學院附屬口腔醫院牙周病科，福建 廈門 36000；.吉林省醫學會秘書處，吉林 長春 3004)

由炎性反應、外傷和某些先天性疾病引發的牙槽骨缺損，是牙槽骨重建相關手術治療重點解決的難題之一。因此，探索新的治療方法以完成牙槽骨的再生修復，對恢復口腔功能具有重要的臨床意義。水凝膠常用于負載生物活性因子，在藥物釋放系統、骨組織工程支架材料體系中被廣泛應用[1]。殼聚糖(CS)水凝膠具有良好的生物相容性和可降解性，是藥物荷載體系中最具應用前景的材料之一[2]。促紅細胞生成素(Erythropoietin , EPO)是一種細胞活性因子，主要功能是調節紅細胞的生成。EPO在造血系統中的作用已經得到廣泛驗證，目前人重組促紅細胞生成素在臨床上廣泛用于治療腎臟移植和貧血患者。除其在紅細胞生成中的經典作用外，糖蛋白促紅細胞生成素(EPO)已被證明在多種非造血組織[3]中發揮細胞保護和再生作用。最近有研究表明EPO能夠刺激骨折修復[4]。因此，本研究主要探討負載EPO的殼聚糖水凝膠在促進骨髓間充質細胞成骨分化中的作用。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1主要材料和試劑:明膠(Sigma)；胎牛血清(FBS，Gibco)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma)；β-甘油磷酸鈉(Merck)；噻唑藍(MTT)；氯化十六烷基吡啶(Sigma)； SYBR?Premix Ex TaqTM (Takara)；RNA 提取試劑盒(北京德邁德公司)；促人紅細胞生成素(EPO，三生藥業有限公司)；DMEM培養基(Gibco)；Primer Script?RT reagent Kit(Takara)。

1.2CS/GP/GA凝膠的合成及凝固時間測定：取一定體積的CS溶液，放置于20 ml無菌容器中，磁力攪拌，同時向CS溶液中逐滴滴加明膠(GA)溶液及β-甘油磷酸鈉(GP)溶液，使用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH值，待各組溶液均勻混合后，將容器靜止放置于37℃環境中，每間隔15 s將容器取出觀察，容器水平傾斜45°，觀察混合溶液液面是否隨容器傾斜而流動，當液面不再隨容器傾斜而流動，則在37℃水浴中繼續放置30 s后將容器取出并完全倒置，若容器內凝膠形狀15 s內不發生明顯的變化，則該溶液視為已完全固化，記錄該反應條件下凝膠溶液固化的時間，即凝膠形成時間，重復實驗3次，取平均值。

1.3檢測EPO-CS/GP/GA的藥物釋放速率：取2 g EPO-CS/GP/GA 水凝膠，置于10 ml PBS中，37℃水浴中孵育，分別于不同時間點(培育2 h、4 h、8 h、24 h、2 d、4 d、10 d和15 d時)吸取上清液，利用Elisa方法檢測上清液中EPO的含量，計算藥物釋放速率。

1.4EPO-CS/GP/GA水凝膠對骨髓間充質細胞增殖及成骨分化作用的影響：取EPO-CS/GP/GA 水凝膠置于定量PBS中，37℃水浴中孵育，分別于2 h、4 h、8 h、24 h、2 d、4 d、10 d和15 d時吸取緩釋液，將緩釋液與骨髓間充質細胞細胞共培養，并誘導成骨向分化，通過MTT實驗觀察EPO-CS/GP/GA 水凝膠浸提液對細胞增殖作用的影響。利用Real time-PCR檢測各組成骨基因的表達情況，結合EPO-CS/GP/GA 水凝膠對細胞增殖作用的影響，總結 EPO 作用下成骨細胞相關基因的變化規律。

2 結果

2.1pH值對水凝膠固化時間的影響:在室溫條件下，將三種材料的溶液均勻混合，殼聚糖：甘油磷酸鈉：明膠按照10∶1∶0.5的比例混合， pH值調節至4.0～7.0，當pH值小于6時，在300 s內沒有觀察到凝膠形成，反應體系依然具有很強的流動性；當pH值為6.5和7.0時，凝膠時間分別為為(135±15)s和(110±15)s。

2.2EPO的緩釋速率:Elisa檢測結果表明，載EPO水凝膠藥物緩釋率在2 h為39.13%，4 d后EPO緩釋率約為80.22%，2周內累計釋放率保持在95%左右。見圖1 。

圖1 Elisa法檢測EPO釋放率的結果

2.3載EPO殼聚糖溫敏水凝膠對細胞增殖及分化作用的影響:通過MTT實驗考察不同時間點吸取的EPO-CS/GP/GA緩釋液(保持EPO濃度不變)對BMSCs細胞增殖效果的影響。結果顯示，培養2 d后，1 d、2 d、4 d、10 d和15 d的EPO-CS/GP/GA緩釋液均對BMSCs的增殖具有促進作用，細胞增殖率均達到120 %以上，與未經處理的EPO作用組無明顯差別。結果表明，經過15 d的緩釋后，凝膠中的EPO依然保持完整的生物學活性，具有促進BMSCs細胞增殖的功能。見圖2。

圖2 不同緩釋時間的凝膠浸提液對骨髓間充質細胞增殖作用的影響

Real time-PCR結果顯示，EPO-CS/GP/GA組成骨基因的表達與空白對照組相比，在第3天時，RUNX2和COL I的表達顯著升高(P<0.01)，SP7的表達也高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；第7天時，EPO-CS/GP/GA組成骨基因RUNX2、COLI和SP7的表達均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，ALP的表達與對照組表達也有提高，差異有統計學意義(P<0.05)；第14天時，EPO-CS/GP/GA組成骨基因RUNX2、COLI、ALP和SP7的表達顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

①為P<0.05，②為P<0.01圖3 水凝膠緩釋液對BMSCs細胞成骨基因表達的影響

3 討論

溫敏水凝膠可作為注射劑型應用，在液體狀態時，通過注射可以將材料遞送至不規則形狀的組織缺損內[5]；在溫度達到成膠條件時凝結成固體，在體內達到良好的填充缺損的功能，負載的藥物可在局部穩定緩慢釋放，達到減少給藥次數并繼續發揮作用的目的[6]。

殼聚糖通常通過共價鍵或非共價鍵與其他天然或合成生物材料結合，形成各種多功能水凝膠[7]，通過細胞和材料的相互作用，達到促進細胞增殖和功能分化的目的[8]，離子交聯法是制備殼聚糖基水凝膠的典型方法，實驗結果表明，離子交聯法所制備的水凝膠具有更優良的生物相容性。有研究證明殼聚糖可以促進成骨細胞的礦物沉積，所以使用殼聚糖作為支架材料成了骨組織修復一個新的選擇。由于殼聚糖是陽離子聚合物，可以通過經典相互作用與其他的粘多糖(GAGs)和蛋白多糖結合，而GAGs可以調節成骨相關的細胞因子和生長因子的表達。因此，基于CS的可注射水凝膠的開發將有助于骨再生的有效治療，特別是對骨組織不規則缺陷部位的治療。

事實上骨移植物不能直接成為受體的功能組織器官，而是與受體的組織交錯融合并逐漸被新沉積的骨質所代替，水凝膠的實質是一個親水性多聚物所構成的三維網絡，而這種高含水量的三維網絡結構與細胞外基質非常相似。促紅細胞生成素的主要功能是調節紅細胞生成，其在造血系統中的作用得到充分驗證，目前人重組促紅細胞生成素已經商品化廣泛應用于臨床治療腎臟移植和貧血患者[9]。除其在紅細胞生成中的經典作用外，促紅細胞生成素已被證明在多種非造血組織[10]中發揮細胞保護和再生作用，在骨修復方面，最近有研究表明EPO能夠刺激骨折修復[11]。EPO可以通過介導Jak/Stat信號通路達到促進骨形成蛋白分泌的目的，直接促進成骨細胞分化，繼而促進骨組織再生修復[12]。Eph受體和Ephrin配體的雙向信號調節破骨細胞與破骨細胞之間的偶聯關系，炎性反應微環境中，這些蛋白在細胞反應和組織重建中發揮重要作用[13]。

EPO在創傷修復中的作用歸因于EPO介導的細胞增殖和血管生成的刺激作用，與此同時，在骨折骨痂周細胞和軟骨細胞中表達的一氧化氮合成酶也被證明在骨修復過程中發揮著關鍵作用[14]，目前研究表明這主要與血管內皮生長因子、內皮型和誘導型一氧化氮合酶的表達增加有關[15-16]。

綜上所述，筆者推斷緩釋EPO可以通過刺激細胞增殖、VEGF介導的血管生成、eNOS和iNOS的表達以及活化Jak/Stat信號通路提高BMP水平，進而促進成骨細胞分化，所有這些都將成為臨床應用EPO治療骨吸收破壞性疾病的潛在可能。